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细胞转分化是一种将分化到终末端的细胞直接转变为另一种细胞的过程,是细胞重编程的一种方式,也是生物体发育和再生过程中自然发生的一种细胞变化现象。近年来,研究人员根据此现象在体外进行模拟,通过过表达某些重编程因子或使用小分子化合物实现培养细胞的转分化和命运转变,进而一步到位获得目的细胞。这一研究可以为解释细胞命运决定提供理论基础,也为组织器官发育和再生医学提供细胞来源,同时还可以为合成生物学相关的人工培育肉的生产提供种子细胞。因此如何在体外更加高效的完成细胞转分化是亟待解决的问题。细胞转分化的发生,表面是基因转录水平的变化导致细胞表型改变,实际上,基因的激活、维持和抑制在一定程度上与基因组表观修饰和染色质三维构象密切相关,两者之间的相互作用是决定细胞命运的驱动力。本研究中,首先通过体外过表达MyoD实现成纤维细胞向成肌细胞的定向转分化,拟从表观基因组层面研究影响细胞转变效率的因素,并从中找到提高目标肌肉细胞生成的策略。本研究根据细胞状态与处理条件将其分为6个细胞群体:成纤维细胞（fibroblast）、对照成纤维细胞（fibroblast＿control）、转分化成纤维细胞（fibroblast＿MyoD）、成肌细胞（myoblast）、shCon处理的细胞（fibroblast＿MyoD shCon）和shCTCF处理的细胞（fibroblast＿MyoD shCTCF）,并采集了不同细胞的HiChIP,ChIP-Seq和RNA-Seq数据,对组蛋白修饰、MyoD和CTCF因子介导的高级染色质结构等特征进行了分析。通过三种数据的整合分析,鉴定转分化前后染色质活性以及染色质互作差异,并进一步通过人为干扰染色质构象,使得染色质构象发生重排,最终实现转分化效率的提高。这种通过改变染色质结构影响多个基因表达的方法,具有操作便捷且应用广泛的特点,能够为提高细胞重编程效率提供一种新的策略。具体结果如下:1.MyoD诱导产生转分化不完全的细胞在成纤维细胞中条件性过表达成肌因子MyoD,实现向成肌细胞的转变,比较转分化成纤维细胞与成肌细胞形成肌管的能力以及基因表达特征,发现转分化成纤维细胞成肌能力低,并且只有很少一部分利于肌肉生成的基因发生了变化,大部分基因仍然和成纤维细胞保持一致,说明MyoD诱导的细胞转分化存在效率较低的问题。2.转分化过程中染色质状态的动态变化通过收集成纤维细胞和转分化成纤维细胞的三种组蛋白ChIP-Seq数据（H3K4me3,H3K27ac和H3K27me3）,鉴定出染色质状态差异的区域,发现转分化成纤维细胞中形成更多的激活状态,而抑制与空白状态均发生下降。更有意思的是,MyoD结合的位置更利于发生激活,从而上调一些成肌相关基因的表达。我们进一步鉴定了转分化前后的增强子元件,并发现新增的增强子利于基因的上调表达,并且这些基因富集在成肌功能相关的通路上。另外,我们还发现转分化中组蛋白修饰的变化对CTCF的结合有一定影响,表现为:结合位置有H3K4me3和H3K27ac修饰的CTCF更容易发生丢失。3.MyoD直接介导的染色质互作调控成肌相关基因的表达利用BL-HiChIP技术,捕获到MyoD直接介导的染色质互作环,通过分析互作类型发现,52%是增强子-增强子互作,30%是增强子-启动子互作。通过比较MyoD介导互作中所关联到的基因,发现结合在增强子位置的MyoD更利于基因的上调表达。正是MyoD介导的远程互作拉近了增强子与基因启动子的距离,从而促进成肌功能基因的激活以及上调表达,如:Has2（Hyaluronic acid 2）和Ca3（Carbonic Anhydrase 3）。另外,我们还发现MyoD和CTCF可以作为共结合因子参与转分化过程中染色质互作的形成。4.转分化过程中CTCF介导的染色质互作调控细胞特异性基因的表达通过分析转分化前后CTCF的ChIP-Seq以及BL-HiChIP数据发现,CTCF的结合位置以及介导的染色质互作是动态变化的,并且变化CTCF互作环中关联的基因表达变化与功能也具有一定的规律,证明CTCF介导的互作调控着细胞特异性基因的表达。此外,我们选择新增的CTCF互作位点进行功能缺失实验,通过CRISPR-Cas9技术、RT-qPCR、3C-qPCR和免疫荧光等实验,证实新增的CTCF互作以及远端增强子对于成肌基因Chrng（Cholinergic Receptor Nicotinic Gamma Subuni）的激活调控起着决定性作用。另外,我们还列举了两个与丢失CTCF互作相关的基因,FBN2（fibrillin 2）和P3h2（Prolyl 3 hydroxylase 2）,正是CTCF互作的丢失,导致该基因在转分化成纤维细胞中表达下降。5.瞬时抑制CTCF导致染色质互作发生重组并促进转分化的发生在诱导转分化过程中,我们采用腺病毒包装的shRNA瞬时抑制CTCF,待CTCF表达水平恢复后,通过MHC（Myosin Heavy Chain）的免疫荧光实验发现:shCTCF处理的细胞具有更高的转分化能力。转录组数据也显示:shCTCF处理的细胞上调表达了成肌功能相关的基因,同时下调了成纤维功能相关的基因。我们进一步通过CTCF的BL-HiChIP、4C-Seq和3C-qPCR研究抑制CTCF的早期与晚期对染色质构象产生的影响。最终发现CTCF的早期抑制扰乱了成纤维细胞中保守的染色质构象,并且有些被影响的互作一直延续到晚期,其中包括的基因有:Serpinb1b（serine peptidase inhibitor,clade B,member 1b）、Pcdhb15和Pcdhb16（protocadherinβ）,它们均在成纤维细胞中特异性高表达,当抑制CTCF后,这些基因发生显著下调,BL-HiChIP、4C-Seq和3C-qPCR的结果显示这些基因所在的互作同样也受到影响。我们进一步用Smart-Seq单细胞测序数据证明早期抑制CTCF可以削弱成纤维细胞的身份,从而促进向成肌细胞的转变。为了进一步验证这一结论的适用范围,我们在猪和鸡的细胞中也进行了测试,结果显示一致。6.转分化后细胞的应用为了拓宽细胞来源,更好地服务实际应用,我们使用小分子化合物进行体外转分化,结果显示:在猪、鸡和小鼠细胞中,小分子化合物均可以诱导成纤维细胞向成肌细胞转分化。接着将转分化后的细胞接种于水凝胶中进行三维立体培养,结果显示该细胞可以很好地生长并形成立体的肌管。于是本研究通过分析转分化中的多组学数据,研究其中的特征与变化并由此寻找提高MyoD诱导转分化效率的方法,最终为人工培育肉的合成提供实验数据和种子细胞材料。