研究背景：亲环素A (CypA)于1984年首次从牛的胸腺中提取获得,是环孢霉素亲和素家族成员之一。CypA由165个氨基酸组成,分子量为18,000,广泛分布在细胞内、细胞外。作为环孢素A (CsA)细胞内受体,后者在临床上可以用作器官移植后排异反应及自身免疫性疾病的治疗药物。CypA具有肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性,参与信号转导,调节多种蛋白活性,起着分子伴侣的作用,并在DNA分子的复制、转录、细胞信号转导、微管形成和修复过程中起到重要作用。炎症和氧化应激是许多疾病主要致病机制。氧自由基是氧化应激的主要标志物,其中与氧化应激最为密切是活性氧簇(ROS)。在心血管系统中,炎症及氧化应激过程已被认为是动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄以及糖尿病性血管病变等心血管病变等心血管疾病的重要促进因素,目前抗氧化治疗对氧化应激损伤所致的心血管疾病无明显疗效,主要因为维生素C及维生素E及其它抗氧化剂在心血管组织中并无特异性。因此探索新的特异性氧化损伤介质及其作用机制对于治疗炎症及氧化应激介导的心血管疾病有重要意义。新近研究表明,CypA是一主要分泌型氧化应激诱导因子(SOXF),在大鼠颈动脉损伤模型、腹主动脉瘤形成、动脉粥样硬化、心肌重塑等心血管疾病发病机制中发挥关键作用[1]。本课题主要通过构建pPICZaB-CypA酵母表达载体,转化X-33毕赤酵母,甲醇诱导表达,然后纯化该蛋白并验证其生物学功能,为进一步研究CypA介导的心血管疾病奠定实验基础。研究目的：1、构建pPICZaB-CypA表达载体,转化毕赤酵母细胞,通过甲醇诱导其表达,纯化分离该蛋白。2、鉴定其具有生物学功能,以用于后续试验。研究方法：1、依据Genbank序列,设计并合成PCR引物,利用RT-PCR获取人CypA目的片段；将PCR产物克隆到peasy-blunt-zero载体,形成peasy-blunt-CypA载体,少量提取质粒,经酶切鉴定及测序鉴定,选出正确克隆；质粒peasy-blunt-CypA经BamH I/Not I酶切,凝胶回收、PCR补平粘性末端获取目的片段；载体pPICZ a B经Kpnl单酶切、补平粘性末端、去磷酸化后回收,获得线性化载体。2、将目的CypA片段与线性化pPICZ a B载体连接,利用酵母转化试剂盒转化酵母细胞,甲醇诱导其分泌表达,在合适的时间点分别取上清进行Western检测表达情况；3、Western证实其表达后,再通过DEAE阳离子交换法纯化分离CypA蛋白,Western检测纯化情况；4、利用Transwell验证纯CypA蛋白对THP-1细胞的趋化作用。研究结果：1、通过酶切及测序验证表达载体的正确性;2、将表达载体pPICZ a B-CypA转化酵母细胞,甲醇诱导目的蛋白表达,Western检测到上清中含有目的蛋白条带,并且其分泌量随诱导时间增长而逐渐增多,表明外源性CypA在酵母细胞真核表达系统中能够表达,并且能分泌到上清中。3、由于CypA的等电点PI=8.79,使用DEAE阳离子交换树脂纯化目的蛋白,Western显示近似单一的目的条带,表明该方法可以有效去除杂蛋白,CypA得到较好的纯化,4、利用transwell及DAPI染色验证纯化的CypA蛋白是否具有生物学活性,实验组小室下壁细胞数与对照组相比有一定的增加,差异具有统计学意义(P<0.01),说明CypA对THP-1细胞有一定的趋化作用。实验结论：1.成功构建了pPICZaB-CypA的表达载体。2.转化毕赤酵母细胞,并且能够成功分泌表达目的蛋白CypA。3.利用DEAE阳离子交换可以有效纯化CypA蛋白。4.重组CypA蛋白对THP-1细胞有一定的趋化作用。