植物病害防治一直是农业生产上的重大课题。长期以来,对植物病害的防治主要采用化学防治,即利用一些特定的化合物制成农药,对病原物进行直接的灭杀或抑制。植物病害的化学防治为提高农产品的产量做出了巨大的贡献,基本满足了人们需求,然而,农药的大量使用将会导致严重的环境污染和农产品质量下降,并直接威胁到人们的健康。因此,寻求符合农业可持续发展的植物病害防治方法是近年来人们关注的热点之一。植物自身有一套精细的免疫系统,在受到病原物侵袭时,能够做出相对应的防卫应答,并能够在整体植株形成抗病性,在之后受到病原物侵袭时更加快速、强烈地产生抗病防卫反应,这就是植物的诱导抗性,也称系统抗性,具有持续性和广谱性,能够帮助植物有效抵御多种不同类型的病原物。除病原物以外,植物诱导抗性还能够被一些微生物、植物来源的代谢物和一些特定化合物诱导,这些物质称为激发子(elicitor)。基于植物诱导抗性的特征,利用激发子代替化学农药来进行植物病害防治,不仅不会造成环境污染,而且对植物病害具有广谱的防治效果。青霉菌灭活菌丝体(Dry mycelium of Penicillium chrysogenum)是工业生产青霉素的残余副产物,是包含菌丝体、代谢物、发酵残余物的混合体,国家规定高温灭活后可排放。前期的研究表明,青霉菌灭活菌丝体可以诱导植物的抗病性,提高植物对多种真菌病害的抵抗能力。然而,关于青霉菌灭活菌丝体诱导植物抗病性的分子机制,以及青霉菌灭活菌丝体提高植物对病毒病害抵抗能力的效果与作用机制尚不清楚。另外,青霉菌灭活菌丝体是包含菌丝体、代谢物和发酵残余物的混合体,然而目前对青霉菌灭活菌丝体中能够诱导植物抗病的关键物质仍不清楚。本文以烟草为实验材料,用生物化学和分子生物学的方法对青霉菌灭活菌丝体诱导植物抗病性的机制进行了系统研究,并提取了其中具有诱导抗病效果的组分,研究其诱导植物系统抗性以抵御病毒病害的效果与作用机理,以期为青霉菌灭活菌丝体和其中的有效组分作为激发子的应用、以及激发子诱导植物抗病毒的分子机制提供理论依据;此外,本文利用分析化学的方法对青霉菌灭活菌丝体中的多肽组分进行了分离纯化,从中筛选出了具有诱导抗病效果的组分,并初步鉴定了这些组分中可能存在的化合物,为青霉菌灭活菌丝体中单一有效成分的鉴定工作提供了研究基础。主要结果如下:(1)对青霉菌灭活菌丝体诱导植物抗病防卫反应的作用和机理进行了系统研究建立了烟草 BY-2(Nicotiana tabacum.Bright Yellow-2)细胞诱导抗性检测体系,研究了青霉菌灭活菌丝体水提取物(Water extract of dry mycelium of Penicillium chuysogenum,DMP)对烟草BY-2细胞抗病防卫反应的诱导作用,并初步探索其机理。研究结果表明:①在DMP诱导下,烟草BY-2细胞苯丙烷途径相关基因表达量显著上调,并大量合成木质素、酚类等抗病次生代谢产物,表明DMP能够激活烟草BY-2细胞次生代谢途径,诱导其合成与抗病相关的次生代谢产物,从而增强抗病性;②DMP能够诱导烟草BY-2细胞活性氧迸发和胞外基质碱性化,表明DMP能够激活烟草BY-2细胞的早期抗病信号;水杨酸(Salicylic acid,SA)信号传导途径标志基因PR-1a和茉莉酸(Jasmonic acid,JA)/乙烯(Ethylene,ET)信号传导途径标志基因PDF1.2在DMP诱导下表达量明显上调,表明DMP能够同时激活多条抗病信号传导途径。(2)对DMP中诱导植物抗性的有效成分进行了分离提取和研究为了解DMP中具有抗病效果的组分,分离出了 DMP中的多糖(Polysaccharide derived from DMP,PsD)和肽类(Peptides derived from DMP,PDMP)提取物,检测了这两类物质对烟草BY-2细胞抗病防卫反应的诱导作用。研究结果表明,PsD和PDMP均能够诱导BY-2细胞的抗病相关基因表达和次生代谢产物积累,是DMP中具有诱导植物抗病效果的关键物质。(3)对PDMP诱导烟草系统抗性的作用和分子机制进行了研究为进一步了解DMP中的有效组分PDMP对植物系统抗性的诱导作用和机制,以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)与心叶烟(Nicotiana glutinosa 互作为体系,探索了 PDMP对心叶烟系统抗性的诱导作用与诱导机制。研究结果显示:PDMP诱导处理后,心叶烟植株诱导叶片和系统叶片抗病相关基因显著上调,TMV接种后,PDMP预处理组接种叶片的枯斑数目和大小均小于对照组,表明PDMP能够有效诱导心叶烟对TMV的系统抗性;抗病信号传导途径相关基因、过敏反应相关基因以及接种叶片肼胝质积累的检测结果表明,PDMP诱导心叶烟系统抗性的机理可能是一方面通过SA-介导的信号传导途径(SA-dependent signaling pathway),激活系统抗病防卫反应,从而增强植株的整体抗性,涉及激发子与植物之间的互作;另一方面,通过JA/ET介导的信号传导途径(JA/ET-dependent signaling pathway)激活启动效应(Priming),在识别 TMV 之后,接种部位细胞比对照植株更加迅速地进入程序性死亡,并合成大量胼胝质以限制TMV的扩散,涉及激发子与植物、以及启动状态下(Primed state)的植物与病原物之间的互作。本研究为PDMP在实际生产中的应用奠定了科学依据,并为激发子诱导抗性烟草对TMV抗病性的分子机制提供了理论基础。(4)研究了 PDMP诱导处理对TMV在易感烟草中胞间运输和系统扩散的影响为比较易感烟草和抗性烟草对PDMP诱导的响应机制,以及PDMP诱导下,易感烟草和抗性烟草抵御TMV的分子机制,利用农杆菌介导的带有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的 TMV 侵染性克隆(agro-p35s-30B:GFP),基于本氏烟和TMV互作体系,研究了 PDMP诱导处理对TMV在本氏烟植株内移动的影响,并探索其机制,结果表明:PDMP诱导处理能够有效限制TMV侵染性克隆在本氏烟植株的胞间运输和长距离扩散,表明PDMP诱导处理能够提高易感烟草对TMV的抗性;接种前后抗病相关基因和接种叶片胼胝质积累检测结果表面明,PDMP诱导的启动效应下,本氏烟接种部位胼胝质的合成是限制TMV扩散的关键因素。本研究揭示了 PDMP诱导易感烟草对TMV抗性的机理,表明在激发子诱导下,易感烟草与抗性烟草对TMV的抵抗机制既有共同点,又存在差异:易感烟草和抗性烟草都通过JA/ET介导的信号传导途径激活启动效应以抵抗TMV,在易感烟草中,接种部位胼胝质的合成是限制TMV扩散的关键因素,而在抗性烟草中,激发子诱导处理下接种部位肼胝质的积累与对照没有明显差异,激发子诱导下抗性增强的原因与接种部位细胞更加迅速地进入程序性死亡有关。本研究也为启动状态下的烟草植株与TMV互作过程中胼胝质合成的调控机制研究提供了理论基础。(5)建立了 DMP中多肽组分分离纯化体系利用分子筛层析和高效液相色谱对DMP中提取的多肽组分进行进一步分离,结果表明,DMP中的多肽由一系列疏水性相似的小分子肽组成,本研究建立了DMP多肽分离纯化和有效组分筛选体系,实现了对DMP中具有诱导抗性作用的小分子肽的初步分离。综上所述,上述工作揭示了 DMP诱导植物抗性的机理和DMP中起主要作用的关键物质,阐释了 DMP中的多肽提取物PDMP诱导抗性烟草和易感烟草TMV抗性的效果和作用机制,并为DMP中具有诱导抗病效果的单一多肽组分分离纯化奠定了工作基础,这些工作对青霉菌灭活菌丝体及其有效组分在农业生产上的应用提供了理论依据。