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研究背景和目的随着现代生活水平的提高、生活方式的改变,环境、代谢因素相关的疾病日趋凸显。作为泌尿科常见疾病之一,肾结石(kidney stones),不仅给患者带来疼痛、手术的痛苦、沉重的经济负担,而且给肾脏功能也带来进行性恶化的远期影响[1][2]。因此对于早期防治肾结石的发生发展就显得尤为重要。最常见的肾结石类型是含钙结石,其中草酸钙结石所占比例将近80%[3]。肾结晶是肾结石早期阶段的表现形式,当前有许多的研究主要集中在探索肾结晶的防治。草酸钙结晶生成的病理生理过程如下:草酸钙晶体激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶,诱发亲环蛋白D(Cyclophilin D)活化,继而发生线粒体通透性转换孔(m PTP)开放、线粒体坍塌,活性氧增多,机体处于较高的氧化应激状态,细胞色素C由坍塌的线粒体释放继而激活Caspase3,这些反应最终导致小管上皮细胞损伤、凋亡,改变细胞膜上磷脂酰丝氨酸的分布,从而促进晶体与小管上皮细胞的粘附,肾结晶的大量形成[4]。于是通过抗氧化、抗凋亡等途径可有效得减少肾结晶沉积,减轻结晶肾损伤。与遗传病(Genetic diseases)相对应,表观遗传学疾病(Epigenetic diseases)是指DNA序列未改变而蛋白质表达异常的疾病[5],在环境相关疾病中起到很重要的作用。组蛋白修饰是表观遗传现象(Epigenetics)之一,包括组蛋白磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化[5][6],而组蛋白乙酰化/去乙酰化对调控基因的转录活化发挥着重大的作用。组蛋白乙酰基转移酶与去乙酰化酶共同调控着组蛋白乙酰化/去乙酰化的动态平衡,当前有研究发现,抑制组蛋白去乙酰化酶可以保护肾脏功能,表现在改善肾脏纤维化、抑制炎症反应、减少小管上皮细胞凋亡[7],并且在急性肾损伤(Acute Kidney Injury)方面取得较好的研究进展[8],提高肾功能恢复的能力。大多数疾病的发生发展与氧化应激有着千丝万缕的联系,抑制氧化应激程度能延缓病程的进展以及逆转某些疾病的恶化。核转录因子(红细胞来源2)相关因子2(即Nrf2)是介导抗氧化反应起保护作用的关键转录因子,它主要是通过激活抗氧化蛋白的转录而发挥作用的。生理情况下,Nrf2是与胞质中Keap1蛋白相偶联,当机体受到氧化应激损伤时,活性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS)产物增多,促使Keap1-Nrf2解偶联,Nrf2迅速进入细胞核,启动抗氧化蛋白表达。而在结晶形成的过程中,随着成石因素逐渐强于抑石因素,机体本身的抗氧化能力逐渐减弱,如果能从外界给予机体抵抗氧化应激的支持,那么就可以阻断结晶的进一步生长。研究表明,在脑缺血再灌注动物模型中,用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACI)进行干预后可激活Nrf2的表达及上调它的下游蛋白分子而起到保护神经的作用[9]。基于抑制组蛋白去乙酰化酶能起到抗纤维化、抗炎、抗氧化等作用,再结合肾结晶的发病机制,本课题是以乙醛酸盐(Glyoxyate)来制造Ca Ox肾结晶的动物模型,给予雄性小鼠腹腔注射辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA),拟验证SAHA对小鼠草酸钙结晶肾损伤的保护作用,并初步探讨相关的分子机制,为临床防治肾结晶损伤提供一定的理论基础。研究内容和方法一、观察SAHA对草酸钙结晶形成的影响,以及对肾模型小鼠肾功能的作用6周龄的ICR雄性小鼠24只,体重20-25克,饲养于第二军医大学动物中心SPF级动物房。适应性喂养一周后,分为4组:A.正常对照组(Control组)B.乙醛酸盐+生理盐水组(Saline组)C.乙醛酸盐+DMSO组(DMSO组)D.乙醛酸盐+SAHA组(SAHA组),每组6只,A组不处理,B、C、D组分别予以Saline、DMSO、SAHA 50mg/kg/d腹腔注射,间隔6小时后均予以乙醛酸盐100mg/kg/d腹腔注射,以上处理连续7天后小鼠入代谢笼,留取24小时尿液,内眦静脉取血,用生理盐水行心室灌流,取一侧肾脏组织置于EP管中冻存于-80°C冰箱,以待检测钙含量,另一侧肾脏组织内固定后浸泡于甲醛中,以待制石蜡切片,行冯库萨(Von kossa)染色。1.通过测定肾脏组织钙含量,尿钙/肌酐比值,观察Von kossa染色及对其半定量分析,来评定SAHA对草酸钙结晶形成的影响。2.检测血清肌酐、血尿素氮(自动生化分析仪),ELISA法分析血KIM-1(kidneyinjury molecular 1),尿KIM-1表达,明确SAHA对结晶肾损伤的影响。二、研究SAHA减轻肾损伤的可能机制如第一部分动物处理,仍然分为4组:A.Control组B.Saline组C.DMSO组D.SAHA组,每组6只,A组不处理,B、C、D组分别予以Saline、DMSO、SAHA50mg/kg/d腹腔注射,间隔6小时后均予以乙醛酸盐100mg/kg/d腹腔注射,以上处理连续7天后小鼠脊椎脱臼处死,用生理盐水行心室灌流,一侧肾脏组织置于EP管中冻存于-80°C冰箱,以待检测MDA、SOD、GSH含量或活力,WB检测Caspase-3,另一侧肾脏组织浸泡于甲醛中,以待制石蜡切片,行免疫组化染色和TUNEL染色。1.检测各组MDA、SOD、GSH含量或活力(比色法)来评价SAHA对模型小鼠氧化应激反应的影响。2.观察比较各组OPN(骨桥蛋白)和CD44在肾脏中的表达。3.检测SAHA对小管上皮细胞凋亡的影响,如观察肾脏组织的TUNEL染色,并行半定量分析,以及Western blot检测Caspase-3的蛋白表达量。结果一、SAHA减少肾结晶的形成,改善肾功能1.与Saline组和DMSO组比较,SAHA组小鼠肾组织的钙含量显著减少,且尿钙/肌酐比值明显降低,Von kossa结果表明沉积在小管腔中的钙盐也显著减少,这些都证实了草酸钙结晶形成被SAHA拮抗。2.血肌酐、血尿素氮在SAHA组明显下降,尿KIM-1排泄也明显减少,对肾功能有明显保护作用。二、SAHA减轻草酸钙结晶肾损伤的相关机制1.SAHA组小鼠肾组织MDA表达较生理盐水对照组、DMSO对照组显著减少,而SOD、GSH表达没有明显差异。2.SAHA组小管上皮细胞凋亡显著减少,Caspase-3表达明显减少。3.SAHA下调OPN、CD44的表达量。结论1、SAHA明显减少模型小鼠肾脏组织的Ca Ox结晶形成2、SAHA能显著改善草酸钙结晶模型小鼠的肾功能3、SAHA能明显抑制氧化应激水平4、SAHA能明显减少肾小管上皮细胞凋亡5、SAHA下调模型小鼠肾组织的OPN、CD44的表达本课题首次将组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA应用于草酸钙肾脏结晶小鼠模型中,发现SAHA能减少肾结晶的形成,减轻肾损伤,并对SAHA发挥效果的作用机制作了初步探讨,可能是通过抗氧化,改善小管上皮细胞凋亡,下调OPN、CD44的表达等来防止肾损伤。这或许为防治肾结石特别是难治性、复发性肾结石提供了新的治疗策略和靶点。