本论文研究得到国家海洋三所基本科研业务项目“海洋源超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的关键理化性质表征与构效关系研究”(海三科No.2015003)、厦门海洋研究开发院共建项目“组织工程用海洋源高纯胶原蛋白的关键制备技术研发及其支架材料安全性的初步评估”,以及福建省科技重大专项“海洋生物资源高值化利用技术研究”(No.2013NZ0003)的资助。Ⅰ型胶原蛋白是目前胶原蛋白领域研究关注度较高、市场应用潜力巨大的胶原蛋白。来自海洋鱼鳞的Ⅰ型胶原蛋白可消除消费者对陆生动物源胶原蛋白可能感染疯牛病、口蹄疫或禽流感的疑虑,并符合犹太教、伊斯兰教和印度教的宗教习俗,因此有望替代陆生动物源胶原蛋白,成为胶原蛋白的新原料。然而,海洋鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白的研究尚存在以下不足:提取工艺得率偏低;分离工艺复杂;缺乏准确定量的方法;氨基酸序列测定研究不足;也未见有其在蛋白修饰与功效预测方面的研究报道。为解决在海洋鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白研究过程中存在的问题,本博士论文进行以下几方面的研究,结果如下:1.PSC快速分离技术的研发采用酶溶提取工艺从海产红鼓鱼鱼鳞中提取低抗原性的酶溶性胶原蛋白(PSC);为解决胶原蛋白传统分离工艺复杂耗时的缺点,将亲水超滤技术应用于提取液中胶原蛋白的分离,该技术可快速分离PSC,分离时间由原来的1～3天缩短到3小时以内,处理胶原蛋白料液,从原来透析不足1升提升到一次可处理45升。所得到的红鼓鱼鱼鳞酶溶性Ⅰ型胶原蛋白以SDS-PAGE测定纯度达到95%以上(电泳纯),命名为红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白,缩写为PSC。2.PSC定量方法的研究采用凝胶色谱(GC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测PSC纯度,结果表明:PSC达到色谱纯;采用RP-HPLC,以峰面积归一化法测定其纯度为94.00%±0.01%;以质量平衡法推算出含量为91.27%±0.01%,并计算出PSC与羟脯氨酸之间转换因子为11.24±0.26。通过该转换因子可以计算一般条件下分离获得的PSC含量。3.PSC理化性质的表征运用质谱、光谱、色谱、电镜、电泳等分析方法较为全面地表征PSC的理化性质。针对热稳定性,选择乌氏粘度法测定PSC的变性温度为27.3℃,另外,通过MALDI-TOF测定PSC的确切分子量为288.2kDa;采用ICP-MS测定PSC蛋白样品的重金属含量,测定结果表明符合国标。4.PSC的结构研究采用全长转录组测序(Full-length transcriptome sequencing)技术,构建专属红鼓鱼鱼鳞的CDS蛋白库;另一方面,采用制备色谱收集PSC在RP-HPLC分离的主峰馏分,进行蛋白鉴定。将鉴定的肽段比对CDS蛋白库,筛选出红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型前胶原蛋白的氨基酸序列;根据肽段分布情况,确定红鼓鱼鱼鳞酶溶性Ⅰ型胶原蛋白,即PSC的氨基酸序列。以NCBI、Uniprot和KEGG三个数据库判定:PSC氨基酸序列的确属于Ⅰ型胶原蛋白,确定PSC为Ⅰ型胶原蛋白。Blast Tree View分析结果证实:红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型前胶原蛋白α1链和α2链均属于目前尚未被报道的硬骨鱼的未知蛋白。Phyre2 Protein Fold Recognition Server预测PSC的结构与人纤维状Ⅰ型前胶原蛋白类似。进一步研究确定了PSC α1亚基的96个脯氨酸羟基化位点和9个赖氨酸羟基化位点,以及α2亚基的84个脯氨酸羟基化位点和5个赖氨酸羟基化位点;并借助Netphos-3.1、NetGlycate 1.0和YinOYang1.2服务器预测PSC氨基酸序列中磷酸化和糖基化的具体修饰位点,初步解释蛋白修饰作用对PSC分子量、溶解性和低抗原性的影响。同时,通过ABCpred服务器预测红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型前胶原蛋白α链N端和C端肽链序列的抗原表位,表明胶原蛋白的N端和C端肽链是主要的抗原决定簇。基于全长转录组测序技术构建的专属红鼓鱼鱼鳞的CDS蛋白库,论文进一步对亲水超滤分离前后的PSC初提物和PSC纯品的SDS-PAGE胶条进行蛋白鉴定,结果显示,亲水超滤分离之前的PSC初提物α链胶条中有33个杂蛋白,其中,α1链上有26个杂蛋白,α2链上有13个杂蛋白,6个杂蛋白在α1链和α2链上均被发现,而亲水超滤分离纯化之后的PSC纯品(色谱纯)α链胶条中则仅有8个杂蛋白,其中,α1链上有6个杂蛋白,α2链上有3个杂蛋白,1个杂蛋白在α1链和α2链上均被发现。亲水超滤前后,PSC α1链中的杂蛋白均多于PSC α2链中的杂蛋白。本论文已将所有杂蛋白的氨基酸序列一一列举;并通过Blast Tree View分析,其中有25个尚未被报道的蛋白。研究发现亲水超滤之前的PSC初提物的α链胶条中,可能存在4种过敏蛋白——parvalbumin beta、tropomyosin alpha-1 chain、beta-enolase和fructose-bisphosphate aldolase A,并通过SWISS-MODEL和Phyre2 Protein Fold Recognition Server预测了它们的结构(见附图)。而亲水超滤之后的PSC纯品的α链胶条中并未发现过敏蛋白的氨基酸序列,这说明亲水超滤技术分离获得的PSC具有低抗原性。根据《中国药典》(2015年版)的相关规定,提供除PSC以外其他杂蛋白详细的氨基酸序列,还通过SWISS-MODEL和Phyre2 Protein Fold Recognition Server预测它们初步的蛋白结构。借助广泛的文献调研和氨基酸序列比对PSC的结构域进行分析与功能预测。分析PSC三螺旋结构稳定性的位点,进一步预测其三螺旋结构。确定可能存在与整合素(ITG)特异性结合的位点;可能与糖蛋白VI(GPVI)有着为数众多的结合位点;PSC还可能直接结合另外两种胶原蛋白受体——白细胞相关的免疫球蛋白样受体(LAIR)和盘状结构域受体(DDR),并与甘露糖受体通过纤维连接蛋白II型(FnII)结构域间接结合。另外,PSC也可能与血管性血友病因子(VWF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、血小板反应蛋白(TSP)、分子伴侣Hsp47、淀粉样前体蛋白(APP)、破骨细胞相关受体(OSCAR)以及肝素均可能有结合位点。这些结果预示本论文所分离获得的PSC可能可以参与并协助不同受体、蛋白和多糖发挥复杂的生物学功能,为今后该胶原蛋白的进一步进行生物工程组织材料和药物的研究奠定基础;同时,通过对比PSC α1链和α2链能够结合的受体、蛋白和多糖的种类,α1链远多于α2链,这种结果与上一节PSC α1链和α2链中杂蛋白的情况一致。5.PSC高效提取技术研发采用低温匀浆技术用来提取红鼓鱼鱼鳞中的I型胶原蛋白,可大幅度提高胶原蛋白的得率,所获得的PSC与前述章节的分离纯度测定等均一致;保湿抗氧化活性测定结果显示:所提取获得的PSC具有优异的吸湿能力与保湿能力;抗氧化活性与陆生动物源的鼠尾I型胶原蛋白和同为水生动物源的三文鱼鱼皮I型胶原蛋白比较,具有显著差异。结果表明本论文研究从红鼓鱼鱼鳞中高效提取制备的PSC具有较好的应用前景。