论文部分内容阅读
DNA生物传感器是将生物的特异性识别能力同DNA序列多变性相结合的传感器件,因自身具有简单、方便、精确、高效率和良好的特异性等特点,DNA生物传感器在近年得到越来越多的关注。G-四联体是由富含鸟嘌呤的DNA序列形成的独特三维结构,而富含鸟嘌呤的DNA序列广泛存在于真核生物的基因组中。本论文选择了 S1核酸酶,三磷酸腺苷(ATP)以及Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)作为检测对象,利用G-四联体同ATP的靶向识别以及对双链DNA的平末端或3’凹陷末端DNA特异性消化的核酸外切酶Ⅲ(exo Ⅲ),G-四联体-血红素的类过氧化物酶活性以及核酸内切酶S1对单链DNA的降解能力,Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)对G-四联体-血红素的类过氧化物酶活性的高效抑制能力设计了高灵敏性和特异性传感的新方法。1.基于G-四联体同ATP的靶向识别以及外切酶Ⅲ(exo Ⅲ)对双链DNA的平末端或3’凹陷末端DNA特异性消化,构建了一个新颖的高灵敏DNA生物传感器。利用发夹DNA和延伸适配体构建了一个无标记的荧光ATP适配体传感器。当ATP存在时,延伸适配体序列会形成exo Ⅲ的优先底物,因此能够诱导酶辅助的扩增,释放富含鸟嘌呤的序列。游离的富含鸟嘌呤的序列能同硫黄素T(ThT)结合,产生增强的荧光信号。当ATP不存在时,延伸序列的空间位阻效应保护发夹DNA不被exo Ⅲ的消化,明显减少了生物传感器的背景信号,极大地提高传感系统的信噪比。提出的适配体传感器在纯样品以及实样检测中均取得了理想的分析结果。2.基于G-四联体-血红素的类过氧化物酶活性以及核酸内切酶S1对单链DNA的降解,构建了一个新颖的高灵敏DNA生物传感器。利用血红素修饰的富含鸟嘌呤的DNA序列构建了一种新型的过氧化物核酶。实验结果证明,通过引入末端修饰的血红素,富含鸟嘌呤的DNA序列能够形成G-四联体结构,高效的完成了 G-四联体结构的组装。相较于传统的G-四联体/血红素结构,G-四联体-血红素展现出更高的过氧化物酶活性。此时,不同于G-四联体/血红素,G-四联体-血红素可一步形成且不需要金属离子和外加血红素的参与,极大地简化了构建步骤,并且大大减少了来自游离血红素产生的背景信号。在验证试验中,根据G-四联体-血红素的比色信号,设计了 S1核酸酶活性检测的新型生物传感器,为设计类过氧化物核酶为基础的生物传感器提供了新视角。3.基于G-四联体-血红素的类过氧化物酶活性以及Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)对其活性的高度抑制性,构建了一个新颖的高灵敏DNA生物传感。我们利用血红素修饰的富含鸟嘌呤的DNA序列(血红素-G-DNA)构建了类过氧化物核酶,该类过氧化物核酶不同于传统的G4/血红素,它可以在不需要金属离子和额外血红素的参与下,一步形成G-四联体-血红素,极大地简化构建过程的同时大幅度减小了背景信号。而Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)则能够通过与鸟嘌呤碱基形成鸟嘌呤-CoⅡ-鸟嘌呤和鸟嘌呤-NiⅡ-鸟嘌呤的错配强烈地抑制G-四联体的形成,进而抑制了 G-四联体-血红素的类过氧化物酶活性,上述原理可以用于Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)的检测。且基于上述现象,我们成功的构建了“NOR”比色逻辑门。