【摘 要】
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纳米抗体具有亲和力高、稳定性好,易改造等常规抗体不具有的优势,近年来在生物诊断领域受到广泛关注。IgM是机体免疫应答时,最先产生并分泌出的抗体,是目前诊断病毒或细菌是近期感染还是活动性感染的重要指标。本研究制备了抗IgM纳米抗体,将其作为酶标记二抗应用于风疹病毒(Rubella virus,RV)IgM阳性血清的检测,主要研究结果如下:1.采用人源IgM免疫羊驼,四次免疫后构建了库容量为3.81×
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纳米抗体具有亲和力高、稳定性好,易改造等常规抗体不具有的优势,近年来在生物诊断领域受到广泛关注。IgM是机体免疫应答时,最先产生并分泌出的抗体,是目前诊断病毒或细菌是近期感染还是活动性感染的重要指标。本研究制备了抗IgM纳米抗体,将其作为酶标记二抗应用于风疹病毒(Rubella virus,RV)IgM阳性血清的检测,主要研究结果如下:1.采用人源IgM免疫羊驼,四次免疫后构建了库容量为3.81×10~8cfu的抗IgM纳米抗体免疫文库。采用固相亲和筛选法获得了16个独特序列的抗IgM纳米抗体,采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)发现,16个独特序列的纳米抗体与IgG、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)和卵清白蛋白(Ovumalbumin,OVA)无交叉反应,特异性好。2.构建上述16个独特序列的纳米抗体-pET-25b重组载体,并实现了原核胞内可溶性表达。探究纳米抗体胞外表达的条件,研究结果表明,在IPTG诱导表达6h和0.25%Triton-X-100条件下胞外表达的纳米抗体M-3-70结合活性最好,表达量为54mg/L,ELISA鉴定其能特异性结合人源IgM。3.构建RV包膜糖蛋白E1第208~245位氨基酸原核表达载体,实现了可溶性表达,表达量为52mg/L。采用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记抗IgM纳米抗体M-3-70,将其作为酶标二抗,应用于纯化的人源IgM和血清中抗RV IgM的鉴定。研究结果表明,ELISA鉴定纯化的人源IgM时,HRP标记纳米抗体M-3-70的工作浓度为100~15ng/mL,在将E 1固定在酶标板孔中用来捕获RV患者血清中IgM的ELISA实验条件下,HRP标记纳米抗体M-3-70(检测二抗)的工作浓度为75ng/mL。
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