细胞色素P450的原核表达及应用于内分泌干扰物双酚A的检测

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细胞色素P450是包含一个血红素蛋白的超大家族,它被发现存在于所有的生物有机体中:从细菌、酵母、真菌、植物、动物以至于人体,这个酶引人注目的特点是能够催化广泛的有机化合物的反应,能使有害物质转变成为可溶物从体内排出。因此它在各种生物合成和生物降解中起着重要的作用。本论文对人细胞色素P4501A2、P4502C9、P4502C19、P4502D6、P4503A4五种人细胞色素P450和NADPH-细胞色素P450还原酶的在大肠杆菌中共表达,表达的蛋白质进行了初步的分离,获得膜蛋白,P450表达水平每升细胞培养物从3.8到38.7 nmol不尽相同,而还原酶的表达水平每升细胞培养物从8.37到33.9 U大小不等,并以双酚A为底物研究了它们的酶活性。利用原核表达获得CYP2C9和NADPH-细胞色素P450还原酶,利用聚丙烯酰胺固定CYP2C9酶于热裂解石墨电极表面,构建相应的生物传感器,实现了CYP2C9的直接电化学,并且研究了CYP2C9的直接电化学行为,进一步应用于其相应底物双酚A的催化氧化研究和分析检测。制备一种纳米羟基磷灰石修饰碳糊电极(Nano-HAP-CPE),并建立了一种灵敏、简便的检测双酚A的电化学分析方法。通过循环伏安法(CV)、计时库仑法(CC)、线性性扫描法(LSV)和差分脉冲伏安法(DPV)等方法研究了BPA在Nano-HAP-CPE电极上的电化学行为,得到电化学动力学参数并优化检测条件。结果表明:Nano-HAP-CPE电极对双酚A有良好的富集作用,在pH7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,双酚A在0.468 V处有一个明显的氧化峰。在最佳条件下,氧化峰电流与双酚A的浓度在8.00×10-8~1.25×10-5 mol/L之间呈线性关系,检出限4.50×10-8 mol/L,用此方法测定了聚碳酸酯塑料瓶中双酚A的含量,回收率为96.10%~103.1%。
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