论文部分内容阅读
目的探讨乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）X区突变特点。分析内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）分子 GRP78、CHOP 与 HBV 相关性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的关系,以及HBVX区突变和内质网应激分子GRP78、CHOP的相关性。方法1.收集2014年1月至2016年12月期间就诊于广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科,首次接受肝切除术治疗且病理确诊为HCC且HBV DNA定量大于500IU/ml的患者57例。提取其肝癌组织和癌旁组织的DNA,采用巢式PCR法扩增HBV X基因片段,Sanger法对扩增产物进行双向测序。以NCBI数据库中国内研究应用较多的HBV X区（NC003977.1）为参考序列,应用Mutation Surveyor 5.1.1软件对HBV X区进行突变分析。利用x2检验分析肝癌组织和癌旁组织中HBVX区位点突变频率的分布。2.采用免疫组织化学染色的方法测定肝癌组织和癌旁组织GRP78、CHOP的表达水平。利用x2检验分析GRP78、CHOP的高表达率在肝癌组织和癌旁组织中的差异。用Mann-Whitney秩和检验分析GRP78、CHOP的表达水平与重点研究的HBV X区热点突变及其联合突变的相关性。3.分析内质网应激分子GRP78、CHOP与临床病理特征的相关性。用Kaplan-Meier法对GRP78高表达组与低表达组、CHOP高表达组和低表达组、重点研究的HBV X区热点突变野生型组和突变型组进行生存分析。结果1.HBV X 区热点突变 G1461C、C1470T、T1544A、A1574T、C1653T、G1742A、A1762T、A1762T/G1764A在肝癌组织和癌旁组织两组间分布有统计学差异（P<0.05）。G1461C引起HBx第30位氨基酸由野生型的缬氨酸突变为亮氨酸;C1470T引起HBx第33位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸;T1544A引起HBx第57位氨基酸、A1574T引起HBx第67位氨基酸、G1742A引起HBx第123位氨基酸发生同义突变;C1653T引起HBx第94位氨基酸由组氨酸突变为络氨酸;A1762T引起HBx第130位氨基酸由赖氨酸突变为蛋氨酸;A1762T/G1764A引起HBx第130位氨基酸由赖氨酸突变为蛋氨酸/131位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸。2.免疫组织化学染色结果显示,GRP78、CHOP蛋白主要在肝癌组织和癌旁组织的细胞浆中表达。GRP78在癌组织和癌旁组织的高表达率分别为78.95%（45/57）,80.70%（46/57）,差异无统计学意义（P>0.05）。CHOP在癌组织和癌旁组织的高表达分别为49.12%（28/57）,78.95%（45/57）,差异有统计学意义（P<0.05）。3.肝癌组织中,HBV X区的8个热点突变里,GRP78在G1461C、A1574T 突变型组表达低（P=0.001,P=0.012）;CHOP 在 A1574T 突变型组表达低（P=0.027）。癌旁组织中,CHOP仅在C1470T突变型组的表达低（P=0.039）。4.肝癌组织中,GRP78 在 G1461C/C1470T、G1461C/A1574T 联合突变型组中表达都低于均不突变组（P=0.007,P=0.001）。CHOP在G1461C/A1574T联合突变组的表达低于均不突变组（P=0.032）。5.GRP78表达与肝硬化、复发、总胆红素、尿素氮有关。CHOP表达与丙氨酸转移酶有关。①HCC合并肝硬化的患者中,肝癌组织GRP78高表达率显著高于无肝硬化的患者（P=0.023）。②HCC有复发的患者中,肝癌组织GRP78高表达率显著高于无复发的患者（P=0.044）。③肝癌组织GRP78高表达患者的总胆红素显著高于GRP78低表达患者（P=0.041）。④肝癌组织GRP78高表达患者的尿素氮显著低于GRP78低表达患者（P=0.035）。⑤肝癌组织CHOP高表达患者丙氨酸氨基转移酶显著低于CHOP低表达患者（p=0.042）。结论1.G1461C、C1470T、T1544A、A1574T、C1653T、G1742A、A1762T、A1762T/G1764A是HBVX区8个可能与肝癌发生发展有关的热点突变。2.GRP78、CHOP均广泛分于肝癌和癌旁细胞的细胞浆内。GRP78表达在肝癌组织和癌旁组织中未显示有统计学差异。CHOP在肝癌组织的表达明显低于癌旁组织,差异有统计学意义。提示肝癌组织诱导凋亡能力下降。3.肝癌组织中,G1461C、A1574T、G1461C/C1470T、G1461C/A1574T突变型组中GRP78表达低。A1574T、G1461C/A1574T突变型组CHOP表达低。提示A1574T、G1461C/A1574T可能通过抑制ERS-凋亡通路,促进肝癌的发生。4.GRP78表达与肝硬化、复发、总胆红素、尿素氮有关。CHOP表达与谷丙转氨酶有关。提示GRP78上调促进ERS,总胆红素产生增加,蛋白质分解代谢减弱,尿素氮生成减少。CHOP上调,诱导细胞凋亡,肝细胞破坏减少,谷丙转氨酶降低。