阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)即人们熟知的老年痴呆,是一种严重的神经退行性疾病。其临床特征表现主要为记忆力缓慢减退、逐渐出现行为举止异常和认知功能障碍,严重者可丧失独立生活能力,患病人群约在病发后十几年内身亡。截至2015年,AD人群数目已经达到4680万,该病已经成为损害老龄人群健康生活的第一大问题。同时,阿尔兹海默症还给患者家属造成了精神负担和医疗费、护理费用等经济压力。然而,目前这种最为常见的神经退行性疾病尚不能治愈,亦无有效延缓手段,因此开发新的阿尔兹海默症有效的治疗方案迫在眉睫。阿尔茨海默症主要有三大病理学特征,包括大脑皮层及海马区内的β淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)大量沉积形成的淀粉样沉积(senile plaque,SP)、异常磷酸化tau蛋白在神经细胞内的聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)以及神经元突触功能异常及神经元细胞的丢失。迄今为止,阿尔兹海默发病的成因以及病发机理并不清楚,研究者均认为脑内Aβ1-42蛋白沉积是引发该病的罪魁祸首。鉴于此理论,研究清除脑内Aβ沉积的疫苗被认为是可以控制阿尔兹海默症病发的有效的手段。然而,Elan公司研发的Aβ1-42多肽主动免疫疫苗的临床实验最终却以失败告终,原因在于Aβ1-42多肽疫苗虽然可以引起抗体反应,但是由于其携带了大量T细胞表位,进而引起患者脑膜脑炎。通过对Aβ序列分析发现,相比于Aβ1-42,Aβ1-6多肽只含有B细胞表位而不含有T细胞表位,多项临床前研究表明Aβ1-6表位疫苗能产生与Aβ1-42疫苗类似的治疗效果而不诱发T细胞反应,因此以Aβ1-6为基础的AD疫苗前景无限。疫苗载体的选择对于免疫效果同样十分重要,理想的疫苗载体系统可以有效提高蛋白疫苗的免疫原性。诺如病毒(NoV)P区域蛋白在形态结构和功能上都是独立的,单独表达的P区域蛋白可以产生有结合活性的抗原二聚体。P区域蛋白不仅可以在体外形成二聚体,还可以形成12、24、36等多种聚集体形式,主要以24聚体形式存在,将其命名为P颗粒(P Particle,PP)。更重要的是在P蛋白上有三个突出的环形结构(loop1,loop2和loop3),可以暴露在P颗粒表面。而且这三个突出环形结构均适合外源片段插入,可以充分地将外源片段展示到P颗粒表面,从而大大提高疫苗的免疫原性。P区域蛋白形成的P颗粒具有很高的免疫原性并且非常稳定,可以在大肠杆菌中高效的表达,这些特性使它成为了一种很有效的疫苗载体。据相关报道,将流感病毒一段短肽M2e和轮状病毒一段长肽VP8分别插入到loop2上进行免疫实验,结果均证实了P颗粒蛋白可以作为疫苗载体,能够提高疫苗的免疫原性。本研究以诺如病毒Hunter株的P区域蛋白序列为模板,通过无义定点突变方法形成一个新的酶切位点EagI,这样P蛋白就可以插入任意目的抗原片段而不改变其原始基因序列。我们将合成好的包含1个拷贝Aβ1-6(1copy-Aβ1-6-loop2)和10个拷贝Aβ1-6(10copy-Aβ-1-6-loop2)的DNA片段通过基因重组的方法分别克隆到质粒pET28a-P domain中,从而获得原核表达质粒pET28a-PP-1copy-Aβ1-6-loop2和pET28a-PP-10 copy-Aβ1-6-loop2。本实验中将上述两种质粒转化到BL21感受态中,诱导表达后通过Ni-NTA柱和superdex200将重组PP蛋白分离并纯化,而后利用粒径和电镜检测重组蛋白的分子量大小和其多聚体聚集状态,至此我们成功制备了两种以诺如病毒P颗粒为载体的嵌合型阿尔兹海默症候选蛋白疫苗。接下来,我们在C57BL/6J小鼠中对这两种候选AD蛋白疫苗进行了免疫原性和安全性的分析。结果发现这两种AD疫苗均可以在体内刺激小鼠产生针对Aβ42的特异性抗体,同时ELISPOT实验结果证实重组P颗粒蛋白不会产生针对于Aβ42的T细胞免疫应答,两种以P颗粒为载体的AD蛋白疫苗具有较高的免疫原性和一定的安全性。综上所述,我们成功构建、表达并纯化了两种以诺如病毒P颗粒为载体的阿尔茨海默症蛋白疫苗,它们在正常小鼠内均能诱导产生较高浓度的Aβ42抗体,同时不会激活针对于Aβ42的T细胞反应。接下来,我们将继续在APP转基因小鼠中评价这两种阿尔茨海默症蛋白疫苗的免疫效果。