鸡球虫属于顶复器艾美耳属原虫，生活史包括细胞内阶段的裂殖生殖、配子生殖和细胞外阶段的孢子生殖。子孢子是鸡球虫入侵肠道细胞的首要阶段，而且顶体膜蛋白1（AMA1）在子孢子阶段高表达，而其他顶复器原虫（弓形虫、疟原虫）的研究中表明AMA1是虫体入侵相关的重要蛋白。本论文以柔嫩艾美耳球虫顶体膜蛋白1（EtAMA1）为诱饵，在柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白，为研究参与子孢子入侵过程中的相关蛋白提供分子基础。1.柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建为构建柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，以纯种柔嫩艾美耳球虫感染鸡7d后收集卵囊，制备并纯化子孢子。利用Trizol提取子孢子总RNA，mRNA试剂盒分离mRNA为模板，以MMLV反转录酶合成cDNA第一链，经LD-PCR扩增得到双链cDNA，再经Chroma Spin TE-400柱纯化后与酵母表达载体pGADT7-Rec连接，共同转化酵母AH109菌感受态，收获克隆得到子孢子cDNA文库。通过缺陷性固体培养基SD/-Leu培养并计数鉴定文库质量。结果：构建的cDNA文库容量为1.1×1012cfu，扩增后文库滴度为2.68×109cfu/mL，重组率为97.44%；随机挑取39个克隆反复冻融后经PCR鉴定显示其插入片段长度在300～2000bp之间；以cDNA文库反复冻融后上清为模板，用柔嫩艾美耳球虫特异性引物扩增到柔嫩艾美耳球虫7种特异性基因（克隆号分别为ZB11-A04、ZBZ-DO7、ZBZ-A03、AMA1、BW4-C03、RON2、ETLDH）。结论：本试验成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，并且在该cDNA文库中成功扩增到柔嫩艾美耳球虫7种特异性基因，为进一步筛选与研究子孢子入侵相关蛋白奠定了基础。2.pGBKT7-EtAMA1诱饵载体的构建为了构建应用于酵母双杂交（Yeast Two-hybrid，Y2H）系统的诱饵载体，以柔嫩艾美耳球虫AMA1基因全长序列为模板，特异性引物扩增柔嫩艾美耳球虫AMA1基因部分序列。将该基因序列连接到pGBKT7酵母表达载体上，构建pGBKT7-EtAMA1诱饵载体，并对该诱饵载体进行鉴定、自转录活性检测和细胞毒性检测。结果：PCR和双酶切鉴定均获得1440bp目的条带；pGBKT7-EtAMA1转Y187、AH109感受态细胞的转化子在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu缺陷性固体培养基上均无克隆生长，且在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal仅生长白色克隆，表明诱饵载体无自转录活性；pGBKT7-EtAMA1转Y187感受态细胞的转化子在SD/-Trp液体培养基培养22h后，其菌液OD600值在0.8以上，且与pGBKT7转化子菌液OD600值无显著差异，表明诱饵载体无细胞毒性。结论：本研究成功构建了pGBKT7-EtAMA1诱饵载体，经鉴定后该诱饵载体无自转录活性和细胞毒性，可应用筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。3.酵母双杂交筛选与EtAMA1相互作用蛋白为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵阶段与EtAMA1相互作用的蛋白，利用酵母双杂交方法将所构建的pGBKT7-EtAMA1诱饵载体与子孢子酵母双杂交cDNA文库进行杂交，用SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu和SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-α-gal缺陷性固体培养基筛选相互作用的蛋白。结果：经过四次筛选后获得了710个蓝色克隆，随机挑选42个蓝斑克隆提质粒后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR鉴定后测序，结果获得了14个不重复的阳性质粒，其中5个未知基因、7个未命名蛋白、2个已报道蛋白（EtZB1-A08和EtMIC2）。已有研究表明EtZB1-A08和EtMIC2是球虫入侵相关蛋白，本研究结果与之相符。结论：本研究利用酵母双杂交方法在子孢子cDNA文库中成功筛选到与EtAMA1相互作用的子孢子入侵相关蛋白，为以后进一步研究子孢子入侵蛋白提供了候选分子。