论文部分内容阅读
C2H2型锌指蛋白是锌指蛋白家族重要的成员,作为转录因子,广泛的参与基因的转录调控,细胞增殖、分化及凋亡等生命活动。本实验室通过RT-PCR从小鼠组织获得2个小鼠基因ZNFD(NM_001004061)和ZBTB9(NM_001005916),SMART分析其结构域表明,ZNFD蛋白C端含有1个C2H2型锌指基序,ZBTB9蛋白N端含有BTB结构域,C端含有2个C2H2型锌指基序,这说明两者都是C2H2型锌指蛋白家族的成员。关于ZNFD和ZBTB9在小鼠中的功能研究尚未有报道,因此,本实验室对这2个基因展开了初步的研究。
(1)首先,通过RT-PCR方法从小鼠睾丸cDNA中获得ZNFD基因,测序结果验证了ZNFD序列的准确性。利用生物信息学的方法对ZNFD的基因和蛋白进行分析,结果表明,ZNFD位于第18号染色体,定位在18qD1。该基因含有1002bp开放阅读框,编码一个由333个氨基酸组成,分子量为37.4kDa的蛋白。对ZNFD进行组织表达谱分析证实ZNFD在小鼠的睾丸中特异性表达,且表达量较高。时间表达谱分析显示ZNFD大约在小鼠出生13天左右开始表达。对ZNFD在7个物种间的同源性分析表明,ZNFD在不同物种间的同源性很高。
通过构建绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-ZNFD对其进行亚细胞定位分析,结果显示ZNFD定位于细胞核。为鉴定ZNFD蛋白N端结构域和锌指结构域对其细胞核定位的影响,构建了一系列截短型ZNFD与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒进行亚定位分析,结果显示ZNFD蛋白N端氨基酸(1-214)对其细胞核定位是必需的,而锌指结构域对ZNFD的细胞核定位不起关键性作用。
应用双荧光素酶报告基因检测系统对ZNFD在AP1(PMA)、HSE、GRE、NF-κB、AP1、CRE、SRE、p53信号通路中的转录调控作用进行分析,结果表明ZNFD对HSE所介导的信号通路具有明显激活作用,且该激活作用具有剂量依赖性。进一步对ZNFD的不同功能区段的转录调控作用分析表明ZNFD蛋白发挥其对HSE元件的转录激活作用需要保持其结构的完整性。pHSE-Luc质粒含有HSE元件,该质粒专门用来检测热休克因子(HSF)的激活以及热休克蛋白介导的信号通路的转录调控。HSE元件通常存在于热休克蛋白基因的启动子区,转录因子通过结合到HSE元件上进而启动下游热休克蛋白基因的表达。本文研究表明ZNFD可能作为热休克蛋白介导的信号通路中的转录激活因子从而调控细胞的一系列生物学功能。
(2)生物信息学分析表明小鼠ZBTB9基因含有一个1380bp的开放阅读框,编码459个氨基酸。起始密码子为ATG,终止密码子为TGA。该基因所编码蛋白的分子量为49.5kDa,对ZBTB9的染色体定位分析表明,ZBTB9位于小鼠17号染色体上,定位在17qA3.3。亚细胞定位分析发现ZBTB9定位在细胞核并且呈斑点状分布。通过构建ZBTB9原核表达载体,在原核表达系统中诱导其融合蛋白的表达,并对蛋白进行纯化,得到了纯化的融合蛋白,为进一步多克隆抗体的制备提供了原材料。