磷酸化蛋白质组学定性与定量分析技术的研究及在肝细胞磷酸化蛋白质组学中的应用

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hjss2008
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蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用,因此也是目前蛋白质组中翻译后修饰研究的热点,系统地对生物样本中磷酸化蛋白质组的研究有助于阐明磷酸化介导的生理病理机制。但由于生物体内磷酸化蛋白质的含量及磷酸化位点的化学计量值常常很低,大规模分析磷酸化蛋白质在技术上还很具有挑战性。肝脏在机体生命活动中执行多种重要生理功能,其中许多功能是通过可逆的磷酸化修饰调节的,对肝细胞模型的磷酸化蛋白质组的研究有助于人们更深入地理解和认识肝脏的复杂功能以及蛋白质的磷酸化修饰在肝脏功能中的意义。本研究分别从定性分析与定量分析两个层面对肝细胞磷酸化蛋白质组进行了研究。第一部分以标准磷酸化蛋白及酵母蛋白质为样本,首先优化了富集磷酸肽的SCX分离技术路线,接着采用SCX—Q—TOF/SCX—LCQ互补的分析策略对人Chang肝细胞中磷酸化蛋白质进行了研究。共鉴定到559个磷酸化位点、409个磷酸化肽段和370个磷酸化蛋白,其中69%(255/370)的磷酸化蛋白和82%(271/327)的磷酸化位点是Swiss-Prot数据库中没有报道的。分析发现其中许多蛋白质在生物体中发挥着与肝脏的生理和病理密切相关的重要功能。该数据集是目前第一个人正常肝细胞磷酸化蛋白质组的报道,为正常肝细胞与癌细胞对照分析提供了依据。第二部分首先建立了18O标记的磷酸化肽段定量分析技术,并对方法学进行了考察和优化。之后建立了IPG—IEF—TiO2联合分离富集方法与高准确度高灵敏度的LTQ—FT液相色谱质谱联用的磷酸化研究策略,通过比较考察发现该策略不但能有效地对磷酸化肽段进行富集,而且与18O标记定量技术兼容性良好,该工作目前还没有相关文献报道。辅助编写了18O标记定量分析配套软件MSOQ,实现了18O标记定量技术数据处理的自动化及规范化。最后将上述建立的18O-IPO-IEF-TiO2-LTQ-FT技术路线用于HepG2/HepG2-HBx细胞模型的定性及定量磷酸化蛋白质组研究。共鉴定到1358个磷酸化位点,958个磷酸化肽段和895个磷酸化蛋白质(groups)。85%的磷酸化蛋白和90%以上的磷酸化位点是Swiss-Prot数据库中没有报道的。从Chang细胞和HepG2细胞中都发现N端磷酸化肽段占很大比例的现象,推断肝细胞中磷酸化修饰有可能更容易发生在蛋白柔韧性好并暴露在外面的N端区域。稳定同位素标记定量分析得到三方面的差异定量信息:157个差异磷酸化位点,182个差异磷酸化蛋白质和1362个差异非磷酸化蛋白质。还发现有一些磷酸化蛋白质在蛋白水平与磷酸化位点的差异不一致的现象。以上信息的获得为探索由于HBx基因的整合而致HCC的分子机制,寻找一批与肝细胞癌发生发展紧密相关的高特异性和灵敏性的生物标记物奠定了基础。
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