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第一部分肝缺血再灌注体内外模型中OTUD4表达水平随时间变化情况
目的：
探索OTUD4在肝脏缺血再灌注体内外模型中表达的时间规律，同时检测NF-κB激活过程中TRAF6的K63泛素化水平。
方法：
1.小鼠肝缺血再灌注(Ischemia and reperfusion, IR)模型的构建。小鼠随机分为四组：假手术组(sham)、I1R3、I1R6、I1R9(“I”代表缺血时长，“R”代表再灌注时长)。
2.ELISA检测不同再灌注时间小鼠血清IL-1β的表达水平。
3.细胞缺氧复氧(Hypoxia reoxygenation, HR)模型的构建。随机分为六组：对照组(Control)、H9R1、H9R2、H9R3、H9R6、H9R9(“H”代表缺氧时长，“R”代表复氧时长)。
4.Western-blot检测IR模型和HR模型中OTUD4及相关蛋白各时间点的表达水平。
5.免疫沉淀与免疫印迹检测TRAF6泛素化。
结果：
1.成功建立了小鼠IR模型，缺血前肝脏呈粉红色，在无创血管夹阻断70%血供后肝脏呈灰白色。
2.Western-blot结果显示：与Sham组相比，IR模型中OTUD4表达的水平下调，且随着再灌注时间延长而逐渐降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。
3.ELISA结果显示：与Sham组相比，IR模型中IL-1β表达的水平上调，且随着再灌注时间延长而逐渐增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。
4.Western-blot结果显示：与对照组组相比，细胞HR模型中p-NF-κBp65蛋白表达水平上调，且随着复氧时间延长而逐渐增加；而OTUD4和IκB-α蛋白表达水平下调，且随着复氧时间延长而逐渐降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。
5.免疫沉淀和免疫印迹结果显示：与对照组相比，细胞HR模型中TRAF6蛋白及其K63泛素化水平上调，且随着复氧时间延长而逐渐增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。
结论：
小鼠IR模型和细胞HR模型OTUD4的表达水平随再灌注/再复氧时间增加而下调；而p-NF-κBp65、TRAF6蛋白及其K63泛素化水平随再灌注/再复氧时间增加而上调。
第二部分OTUD4在肝脏缺血再灌注体外模型中的作用及其机制研究
目的：
探索OTUD4与TRAF6的K63泛素化修饰以及NF-κB的激活间的关系，初步探索OTUD4在肝缺血再灌注体外模型中的作用及其机制。
方法：
1.免疫共沉淀与免疫印迹检测TRAF6和OTUD4的相互作用。
2.构建OTUD4过表达慢病毒，感染细胞后筛选稳定株。
3.OTUD4过表达慢病毒(Lentivirus transfect- OTUD4 overexpression，LV-OTUD4)和空载慢病毒感染细胞72h后，将细胞分为三组：未转染的细胞作为对照组(Control)、空载组(negative control, NC)、LV-OTUD4组。用Western-blot检测OTUD4和TRAF6蛋白表达水平，验证OTUD4的过表达效果。
4.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：未缺氧复氧的细胞作为对照组(Control)、缺氧复氧处理的未转染细胞为HR组、缺氧复氧处理的空载细胞组(HR+NC)、缺氧复氧处理的OTUD4过表达细胞组(HR+LV-OTUD4)。用免疫沉淀与免疫印迹验证过表达OTUD4对TRAF6泛素化的影响。
5.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：Control组、HR组、HR+NC组、HR+LV-OTUD4组。Western-blot检测过表达OTUD4对NF-κB激活的影响。
6.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：Control组、HR组、HR+NC组、HR+LV-OTUD4组。用细胞免疫荧光检测过表达OTUD4对NF-κBp65转运入核的影响。
7.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：Control组、HR组、HR+NC组、HR+LV-OTUD4组。用ELISA检测细胞上清中炎症因子IL-1β表达水平的影响。
结果：
1.免疫共沉淀和免疫印迹结果显示：OTUD4蛋白与TRAF6蛋白在RAW264.7细胞中存在直接结合。
2.成功用OTUD4过表达慢病毒感染细胞并获得稳定株。
3.Western-blot结果显示：对照组与NC组OTUD4和TRAF6蛋白的表达无统计学差异；LV-OTUD4组TRAF6蛋白表达与对照组无统计学差异，但OTUD4蛋白表达量明显增高(P<0.05)。
4.免疫沉淀和免疫印迹结果显示：与对照组相比，HR组TRAF6蛋白及其K63泛素化水平上调(p<0.05)。与HR组相比，HR+NC组TRAF6蛋白及其K63泛素化水平无统计学差异；与HR组相比，HR+LV-OTUD4组TRAF6蛋白表达水平与HR组无统计学差异，但TRAF6的K63泛素化水平表达下调(p<0.05)。
5.Western-blot结果显示：与对照组相比，HR组IκB-α和OTUD4蛋白表达水平下调，而p-NF-κBp65和TNF-α蛋白表达水平上调(p<0.05)。与HR组相比，HR+NC组中TNF-α、p-NF-κBp65、IκB-α和OTUD4蛋白表达水平无统计学差异；与HR组相比，HR+LV-OTUD4组中OTUD4和IκBα蛋白表达水平上调，而TNF-α、p-NF-κBp65蛋白表达水平表达下调(p<0.05)。
6.细胞免疫荧光结果显示：对照组的NF-κBp65主要分布于细胞核外。与对照组相比，HR组NF-κBp65入核率增加，在核内可观察到大量红色荧光。与HR组相比，HR+NC组的NF-κBp65入核情况无明显差异，而HR+LV-OTUD4组入核率减少，在核内仅可观察到少量红色荧光。
7.ELISA结果显示：与对照组相比，HR组IL-1β表达水平上调(p<0.05)。与HR组相比，HR+NC组中IL-1β表达水平无统计学差异；与HR组相比，HR+LV-OTUD4组中IL-1β表达水平下调(p<0.05)。
结论：
细胞实验证实过表达OTUD4对TRAF6蛋白表达水平无影响，但可通过去除TRAF6的K63多聚泛素链从而负向调节NF-κB的激活，抑制炎症因子的释放。
第三部分OTUD4在小鼠肝脏缺血再灌注体内模型中的作用
目的：
在体内模型中探讨OTUD4在肝脏缺血再灌注损伤中发挥的作用。
方法：
1.小鼠IR模型的构建，小鼠随机分为四组：假手术组(sham)、IR组、IR+NC组、IR+LV-OTUD4组(“I”代表缺血时长，“R”代表再灌注时长)。小鼠建立IR模型前2周，经C57BL/6J小鼠尾静脉分别注射空载慢病毒和OTUD4过表达慢病毒到相应组别。
2.用Western-blot检测过表达OTUD4对NF-κB激活的影响。
3.ELISA检测小鼠血清中炎症因子IL-1β表达水平的影响。
4.微板法检测小鼠血清中AST及ALT的水平。
5.肝脏组织HE染色检测肝脏组织损伤情况。
结果：
1.Western-blot结果显示：与sham组相比，IR组IκB-α和OTUD4蛋白表达水平下调，而p-NF-κBp65和TNF-α蛋白表达水平上调(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组TNF-α、p-NF-κBp65、IκB-α和OTUD4蛋白表达水平无统计学差异；与IR组相比，IR+LV-OTUD4组OTUD4和IκBα蛋白表达水平上调，而TNF-α、p-NF-κBp65蛋白表达水平表达下调(p<0.05)。
2.ELISA结果显示：与sham组相比，IR组IL-1β表达水平上调(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组IL-1β表达水平无统计学差异；与IR组相比，IR+LV-OTUD4组中IL-1β表达水平下调(p<0.05)。
3.微板法检测小鼠血清的结果显示：与sham组相比，IR组AST和ALT表达水平上调(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组中AST和ALT表达水平无统计学差异；与IR组相比，HR+LV-OTUD4组中AST和ALT表达水平下调(p<0.05)。
4.肝脏HE染色结果显示：sham组小鼠肝脏结构正常，肝细胞形态大小正常，无炎症细胞浸润或气球样变等病理特征。与sham组相比，IR组结构紊乱、细胞坏死、炎性浸润明显且SUZUKI评分增加(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组细胞损伤程度和炎性浸润无明显差别，SUZUKI评分无统计学差异；与IR组相比，IR+LV-OTUD4组中细胞坏死范围缩小、炎性浸润和空泡形成减少且SUZUKI评分减少，差异具有统计学意义(p<0.05)。
结论：
小鼠体内实验证实过表达OTUD4可负向调节NF-κB的激活，抑制炎症因子的释放；减轻缺血再灌注引起的肝脏组织损伤。
目的：
探索OTUD4在肝脏缺血再灌注体内外模型中表达的时间规律，同时检测NF-κB激活过程中TRAF6的K63泛素化水平。
方法：
1.小鼠肝缺血再灌注(Ischemia and reperfusion, IR)模型的构建。小鼠随机分为四组：假手术组(sham)、I1R3、I1R6、I1R9(“I”代表缺血时长，“R”代表再灌注时长)。
2.ELISA检测不同再灌注时间小鼠血清IL-1β的表达水平。
3.细胞缺氧复氧(Hypoxia reoxygenation, HR)模型的构建。随机分为六组：对照组(Control)、H9R1、H9R2、H9R3、H9R6、H9R9(“H”代表缺氧时长，“R”代表复氧时长)。
4.Western-blot检测IR模型和HR模型中OTUD4及相关蛋白各时间点的表达水平。
5.免疫沉淀与免疫印迹检测TRAF6泛素化。
结果：
1.成功建立了小鼠IR模型，缺血前肝脏呈粉红色，在无创血管夹阻断70%血供后肝脏呈灰白色。
2.Western-blot结果显示：与Sham组相比，IR模型中OTUD4表达的水平下调，且随着再灌注时间延长而逐渐降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。
3.ELISA结果显示：与Sham组相比，IR模型中IL-1β表达的水平上调，且随着再灌注时间延长而逐渐增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。
4.Western-blot结果显示：与对照组组相比，细胞HR模型中p-NF-κBp65蛋白表达水平上调，且随着复氧时间延长而逐渐增加；而OTUD4和IκB-α蛋白表达水平下调，且随着复氧时间延长而逐渐降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。
5.免疫沉淀和免疫印迹结果显示：与对照组相比，细胞HR模型中TRAF6蛋白及其K63泛素化水平上调，且随着复氧时间延长而逐渐增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。
结论：
小鼠IR模型和细胞HR模型OTUD4的表达水平随再灌注/再复氧时间增加而下调；而p-NF-κBp65、TRAF6蛋白及其K63泛素化水平随再灌注/再复氧时间增加而上调。
第二部分OTUD4在肝脏缺血再灌注体外模型中的作用及其机制研究
目的：
探索OTUD4与TRAF6的K63泛素化修饰以及NF-κB的激活间的关系，初步探索OTUD4在肝缺血再灌注体外模型中的作用及其机制。
方法：
1.免疫共沉淀与免疫印迹检测TRAF6和OTUD4的相互作用。
2.构建OTUD4过表达慢病毒，感染细胞后筛选稳定株。
3.OTUD4过表达慢病毒(Lentivirus transfect- OTUD4 overexpression，LV-OTUD4)和空载慢病毒感染细胞72h后，将细胞分为三组：未转染的细胞作为对照组(Control)、空载组(negative control, NC)、LV-OTUD4组。用Western-blot检测OTUD4和TRAF6蛋白表达水平，验证OTUD4的过表达效果。
4.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：未缺氧复氧的细胞作为对照组(Control)、缺氧复氧处理的未转染细胞为HR组、缺氧复氧处理的空载细胞组(HR+NC)、缺氧复氧处理的OTUD4过表达细胞组(HR+LV-OTUD4)。用免疫沉淀与免疫印迹验证过表达OTUD4对TRAF6泛素化的影响。
5.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：Control组、HR组、HR+NC组、HR+LV-OTUD4组。Western-blot检测过表达OTUD4对NF-κB激活的影响。
6.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：Control组、HR组、HR+NC组、HR+LV-OTUD4组。用细胞免疫荧光检测过表达OTUD4对NF-κBp65转运入核的影响。
7.LV-OTUD4感染感染细胞72h后，将细胞分为四组：Control组、HR组、HR+NC组、HR+LV-OTUD4组。用ELISA检测细胞上清中炎症因子IL-1β表达水平的影响。
结果：
1.免疫共沉淀和免疫印迹结果显示：OTUD4蛋白与TRAF6蛋白在RAW264.7细胞中存在直接结合。
2.成功用OTUD4过表达慢病毒感染细胞并获得稳定株。
3.Western-blot结果显示：对照组与NC组OTUD4和TRAF6蛋白的表达无统计学差异；LV-OTUD4组TRAF6蛋白表达与对照组无统计学差异，但OTUD4蛋白表达量明显增高(P<0.05)。
4.免疫沉淀和免疫印迹结果显示：与对照组相比，HR组TRAF6蛋白及其K63泛素化水平上调(p<0.05)。与HR组相比，HR+NC组TRAF6蛋白及其K63泛素化水平无统计学差异；与HR组相比，HR+LV-OTUD4组TRAF6蛋白表达水平与HR组无统计学差异，但TRAF6的K63泛素化水平表达下调(p<0.05)。
5.Western-blot结果显示：与对照组相比，HR组IκB-α和OTUD4蛋白表达水平下调，而p-NF-κBp65和TNF-α蛋白表达水平上调(p<0.05)。与HR组相比，HR+NC组中TNF-α、p-NF-κBp65、IκB-α和OTUD4蛋白表达水平无统计学差异；与HR组相比，HR+LV-OTUD4组中OTUD4和IκBα蛋白表达水平上调，而TNF-α、p-NF-κBp65蛋白表达水平表达下调(p<0.05)。
6.细胞免疫荧光结果显示：对照组的NF-κBp65主要分布于细胞核外。与对照组相比，HR组NF-κBp65入核率增加，在核内可观察到大量红色荧光。与HR组相比，HR+NC组的NF-κBp65入核情况无明显差异，而HR+LV-OTUD4组入核率减少，在核内仅可观察到少量红色荧光。
7.ELISA结果显示：与对照组相比，HR组IL-1β表达水平上调(p<0.05)。与HR组相比，HR+NC组中IL-1β表达水平无统计学差异；与HR组相比，HR+LV-OTUD4组中IL-1β表达水平下调(p<0.05)。
结论：
细胞实验证实过表达OTUD4对TRAF6蛋白表达水平无影响，但可通过去除TRAF6的K63多聚泛素链从而负向调节NF-κB的激活，抑制炎症因子的释放。
第三部分OTUD4在小鼠肝脏缺血再灌注体内模型中的作用
目的：
在体内模型中探讨OTUD4在肝脏缺血再灌注损伤中发挥的作用。
方法：
1.小鼠IR模型的构建，小鼠随机分为四组：假手术组(sham)、IR组、IR+NC组、IR+LV-OTUD4组(“I”代表缺血时长，“R”代表再灌注时长)。小鼠建立IR模型前2周，经C57BL/6J小鼠尾静脉分别注射空载慢病毒和OTUD4过表达慢病毒到相应组别。
2.用Western-blot检测过表达OTUD4对NF-κB激活的影响。
3.ELISA检测小鼠血清中炎症因子IL-1β表达水平的影响。
4.微板法检测小鼠血清中AST及ALT的水平。
5.肝脏组织HE染色检测肝脏组织损伤情况。
结果：
1.Western-blot结果显示：与sham组相比，IR组IκB-α和OTUD4蛋白表达水平下调，而p-NF-κBp65和TNF-α蛋白表达水平上调(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组TNF-α、p-NF-κBp65、IκB-α和OTUD4蛋白表达水平无统计学差异；与IR组相比，IR+LV-OTUD4组OTUD4和IκBα蛋白表达水平上调，而TNF-α、p-NF-κBp65蛋白表达水平表达下调(p<0.05)。
2.ELISA结果显示：与sham组相比，IR组IL-1β表达水平上调(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组IL-1β表达水平无统计学差异；与IR组相比，IR+LV-OTUD4组中IL-1β表达水平下调(p<0.05)。
3.微板法检测小鼠血清的结果显示：与sham组相比，IR组AST和ALT表达水平上调(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组中AST和ALT表达水平无统计学差异；与IR组相比，HR+LV-OTUD4组中AST和ALT表达水平下调(p<0.05)。
4.肝脏HE染色结果显示：sham组小鼠肝脏结构正常，肝细胞形态大小正常，无炎症细胞浸润或气球样变等病理特征。与sham组相比，IR组结构紊乱、细胞坏死、炎性浸润明显且SUZUKI评分增加(p<0.05)。与IR组相比，IR+NC组细胞损伤程度和炎性浸润无明显差别，SUZUKI评分无统计学差异；与IR组相比，IR+LV-OTUD4组中细胞坏死范围缩小、炎性浸润和空泡形成减少且SUZUKI评分减少，差异具有统计学意义(p<0.05)。
结论：
小鼠体内实验证实过表达OTUD4可负向调节NF-κB的激活，抑制炎症因子的释放；减轻缺血再灌注引起的肝脏组织损伤。