恶性肿瘤是世界范围内主要致死性疾病之一,亦是严重威胁人类生命健康的常见疾病[1]。恶性肿瘤异常增殖、抵抗凋亡以及侵袭转移等生物学特性,给肿瘤治疗带来了巨大挑战。传统的治疗手段尚无法从根本上治疗恶性肿瘤,且多伴随明显毒副作用,给患者带来痛苦,影响患者生活质量。近年来,分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新策略,以其特异性强,副作用小等治疗优势逐渐被推崇,许多分子靶向药物已获FDA批准投入临床,并取得了较好的临床疗效。分子靶向治疗策略的核心是靶点的确定,通过对肿瘤分子机制不断的深入研究,寻找精准靶点,是攻克肿瘤的关键所在。免疫球蛋白超家族成员CD147分子是近年来报道较多的肿瘤相关分子(Tumor associated molecule,TAM)。研究表明,CD147分子在近20种不同来源的恶性肿瘤中呈现异常表达,并且通过不同的形式参与肿瘤发生,增殖,分化,侵袭转移,凋亡抵抗以及代谢等多种生物学事件,而通过干涉、敲除、阻断等方式抑制CD147的异常表达后,可以逆转肿瘤的恶性表型[2]。随着研究的深入,又成功解析了CD147分子的晶体结构,从而使基于分子结构的特异性药物筛选成为可能。可以说CD147已经具备了肿瘤的药物靶点特性,然而目前尚无靶向CD147的小分子药物。综上所述,本课题旨在基于CD147的分子结构,设计筛选出能够靶向CD147的抗肿瘤小分子抑制剂,并对其分子机制进行深入探讨。本课题主要包括三部分工作:第一部分,靶向CD147的小分子化合物的虚拟筛选及先导化合物AC-73的确定。我们应用计算机辅助药物筛选平台,以CD147的三维晶体结构为模型进行药效团模型的建立。随后对来自SPECS小分子化合物库中的近30万小分子化合物进行虚拟筛选和评分,最终得到综合排名靠前的100个候选小分子化合物。进一步通过SPR试验以及明胶酶谱试验对100个化合物进行初筛,确定了一个先导化合物AC-73。最后我们通过SPR试验,分子对接模拟技术以及点突变等试验预测AC-73与CD147结合时,可能存在的结合位点为CD147胞外段N端GLU64以及GLU73位氨基酸残基。第二部分,小分子化合物AC-73阻抑肝癌侵袭转移及分子机制研究。这一部分研究中,我们用CD147参与的恶性肿瘤中报道较多的肝细胞癌为研究模型,探讨AC-73的功能及分子机制。应用细胞划痕试验和侵袭小室试验,发现AC-73能够在体外抑制肝癌细胞迁移运动和侵袭转移,且该运动和侵袭能力的降低并非由AC-73影响了细胞活性所致。进一步通过比较AC-73在野生型肝癌细胞系和特异性敲除CD147的肝癌细胞系的药物活性的差异,证实AC-73抑制肝癌细胞运动和转移的能力是通过特异性靶向CD147实现的。应用Native SDS-PAGE/Western blot、明胶酶谱、RT-q PCR、蛋白免疫印迹等试验,对AC-73分子机制进行研究,结果表明AC-73可以通过抑制CD147同源二聚体形成的方式,下调CD147/ERK1/2/STAT3/MMP-2分子信号通路,从而抑制肝癌细胞发生侵袭转移。AC-73的上述功能特性和分子信号机制,在裸鼠肝原位移植瘤模型内进行了验证,并得到了证实。体内毒性试验显示,AC-73在小鼠体内耐受性较好,毒副作用小,具有良好的成药潜能。第三部分,AC-73改造化合物HA-08的抑瘤特性及促凋亡机制研究。在这一部分探索性工作中,我们对AC-73进行了结构改造,初期获得了八个改造化合物。经过分子对接模拟以及SPR试验初筛,得到一个能够与CD147相互作用的小分子化合物HA-08。对该小分子化合物进行了合成及纯化,用于后期的功能研究。侵袭小室试验证明,HA-08可以抑制肝癌细胞发生侵袭转移,同时发现HA-08对肝癌细胞活性产生了影响。Native SDS-PAGE/Western blot试验证实HA-08不能够抑制CD147形成同源二聚,提示HA-08的分子机制与AC-73存在差异。随后,我们应用WST-1试验检测了HA-08对9种不同肿瘤细胞活性影响,发现HA-08对肿瘤细胞具有较普遍的抑瘤活性。通过Annexin V-FITC/PI流式检测、JC-1和Hoechst染色以及Western blot等试验,发现HA-08能够促进肿瘤细胞发生凋亡,主要体现为诱导凋亡表型的出现以及凋亡相关蛋白水平的变化。HA-08的抑瘤特性以及促凋亡能力在荷瘤裸鼠模型上得到了证实。最后我们通过比较HA-08在CD147表达水平不同的肿瘤细胞的敏感性差异,明确HA-08的抑瘤活性和促肿瘤细胞凋亡的能力与CD147呈现显著相关性。