目的：　　 椎间盘突出症是临床骨科的常见病和多发病,也是腰腿痛和颈肩痛的主要原因,严重影响了人们的生活质量,使大量的社会劳动力丧失,给国家与社会带来沉重的负担。椎间盘突出是在椎间盘退变的基础上发生的,二者的共同特征是髓核内细胞外基质成分的显著改变,诸如蛋白多糖含量的减少,导至髓核含水量下降、纤维环裂隙形成等。椎间盘的累积性损伤也能够触发持续性炎症反应Ⅲ而产生一系列的炎性细胞因子,促进椎间盘退变的加速。作为一种炎性细胞因子,大麻素(Cannabinoid,CB)自发现以来备受关注,在多个系统中参与炎症反应,目前对于关节软骨细胞的作用研究较多,在椎间盘退变过程中大麻素参与机制的研究国内外才刚起步,本研究旨在揭示CB在累积性损伤所致椎间盘慢性炎症反应过程中的表达规律。随着基因强化组织工程学的发展,对椎间盘退变进行分子水平上的治疗已成为可能,本研究通过采用基因治疗的两种方法:体外基因修饰干细胞和直接体内基因转染椎间盘细胞,使其在髓核组织内持续表达目的基因,以减慢椎间盘退变的进程,对这两种基因治疗的效果进行比较和评价,为临床应用基因疗法治疗椎间盘退变提供科学依据。　　 方法：　　 (一)大麻素在累积性损伤所致椎间盘慢性炎症反应中的表达及意义的初步研究　　 1、动物模型制备及形态学观察:　　 根据Jill A.Ulrich制作方法,制备大鼠尾椎反复刺伤模型。在术后第3,7,10天,取材进行HE染色。　　 2、应用RealTime-PCR方法检测FAAH、NAAA、CB-1R、CB-2R:　　 根据大鼠椎间盘相关基因序列,设计引物,利用RealTime-PCR方法检测4种目标基因FAAH、NAAA、CB-1R、CB-2R在大鼠椎间盘退变模型中的表达规律。　　 3、Western Blot法检测CB-2R蛋白含量:　　 提取大鼠椎间盘退变模型髓核后,利用Western Blot方法检测CB-2R蛋白含量的变化。　　 (二)GDF-5体外转染BMSC移植对退变椎间盘的作用　　 1、兔BMSC分离培养及鉴定　　 采用密度梯度离心法,分离、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行体外培养扩增,并进行细胞形态学、表型组织化学染色观察。　　 2、脂质体介导的pcDNA3.1(+)/GDF.5重组质粒转染BMSC　　 取第三代原代培养细胞,脂质体法转染,G418筛选稳定表达株,用倒置显微镜观察细胞的生长情况和形态学变化,RT-PCR检测转染是否成功。　　 3、动物手术及2个月椎间盘修复效果检测　　 转染细胞组、普通BMSC组,对照组分别注入相应混合物,2个月后RT-PCR观察基因治疗稳定性,并通过髓核蛋白多糖含量,髓核细胞凋亡率观测修复效果。　　 (三)GDF-5活化基质体内转染对退变椎间盘的作用　　 1、基因活化基质的制备　　 Ⅰ型胶原支架切成直径1mm长5mm的长条经环氧乙烷消毒后备用,按2μl脂质体含有1μg质粒的比列稀释,将支架放入其中浸泡30min后进行动物手术。　　 2、动物手术后2个月椎间盘退变修复效果检测　　 日本大耳白兔随机分为GAM组,普通支架组,对照组,取术后2个月各组兔椎间盘的髓核,间苯三酚法测蛋白多糖含量,用流式细胞仪检测髓核细胞的凋亡率,RT-PCR技术检测基因治疗稳定性。　　 (四)GDF-5体外转染BMSC移植以及GAM体内转染对椎间盘退变修复作用的比较　　 日本大耳白兔随机分为正常组,转染细胞组,GAM组,对照组,分别在相应组中放入目标物正常组不予任何处置,转染细胞组置入已转染GDF-5的BMSC,GAM组置入GDF-5活化基质,对照组仅穿刺),取术后2个月各组兔椎间盘的髓核,间苯三酚法测蛋白多糖含量,用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率,RT-PCR技术检测基因治疗的稳定性。　　 结果：　　 (一)大麻素在累积性损伤所致椎间盘慢性炎症反应中的表达及意义　　 1、HE染色:10天组可见刺伤所致纤维环断裂,髓核内出血。　　 2、Real-time PCR结果显示:NAAA和FAAH在椎间盘累积性损伤7天时,表达含量约为对照组的三倍左右,并形成高峰,10天后表达量呈减少趋势。　　 3、Western Blot结果显示:大麻素受体表达逐渐增高。　　 (二)GDF-5体外转染骨髓间充质干细胞移植对退变椎间盘的作用　　 1、刚接种BMSC的培养瓶中为大量小圆形细胞,2-3天出现少数长梭形细胞;5-7天后小圆形细胞消失,长梭形细胞数量逐渐增多,成簇生长,呈放射状排列;10-20天开始呈对数生长。传至第3代时细胞呈漩涡样生长。　　 2、CD29,CD105免疫荧光标记显示:细胞胞膜呈绿色,细胞的表型标记表达阳性,CD34免疫细胞化学染色和免疫荧光染色细胞胞膜无着色,呈阴性结果。　　 3、RT-PCR结果显示转染48小时后以及移植手术后2个月GDF-5基因稳定表达。　　 4、髓核蛋白多糖含量统计结果为:对照组与其他两组比较有显著统计学差异(P＜0.01);转染细胞组与BMSC组之间有统计学差异(P=0.05)。　　 5、髓核细胞凋亡率统计结果为:对照组与其他各组之间有显著差异(P＜0.01),转染细胞组与BMSC组之间差异没有统计学差异(P=0.09)。　　 (三)GDF-5基因活化基质体内转染对退变椎间盘的作用　　 1、RT-PCR结果显示术后2个月GDF-5基因稳定表达。　　 2、蛋白多糖含量的检测:GAM组和另外两组之间具有统计学差异(P＜0.05),空白支架组和对照组之间没有统计学差异(P=0.601)。　　 3、髓核细胞凋亡率检测:GAM组和另外两组之间具有显著差异(P＜0.01),空白支架组和对照组之间没有统计学差异(P=0.902)。　　 (四)GDF-5体外转染BMSC移植以及GAM体内转染对椎间盘退变修复作用的比较　　 1、髓核蛋白多糖含量统计结果为:转染细胞组与正常组之间没有统计学差异(P=0.149);其余各两组间比较都具有显著的统计学差异(P＜0.01)。　　 2、髓核细胞凋亡率检测:正常组与转染细胞组之间具有统计学差异(P=0.012),其余各组两两相比都具有显著差异(P＜0.01)。　　 结论：　　 1、本实验所建立椎间盘退变动物模型可靠。　　 2、CB参与了累积性损伤椎间盘组织中相关反应,第7天时候表达含量呈低谷,而随着时间的延长逐渐增高。　　 3、移植自体BMSC或者经GDF-5修饰的BMSC对退变椎间盘都有修复作用,而后者的修复效果更好。　　 4、利用GAM可以有效的进行GDF-5基因体内转染。　　 5、与利用GAM进行体内转染比较,体外转染BMSC然后再移植入体内的方法修复椎间盘退变的效果更好。