血管内皮最基本的功能是对液体、蛋白质和细胞维持有效的选择性屏障,同时允许高效的气体弥散和电解质、炎性细胞的转运。由基底胶原、单层内皮细胞、细胞间紧密连接蛋白共同构成的毛细血管壁是血液与细胞外液物质交换、新陈代谢的基础。而在炎症、创伤等病理状态下,由于毛细血管血流量的变化、内皮细胞的损伤和凋亡、紧密连接蛋白的破坏会增大毛细血管通透性,导致毛细血管渗漏,进而发展为器官功能障碍,诱发多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)。调节血管内皮屏障功能的机制、以及病理状态下内皮屏障的重建和治疗策略已经成为目前的研究热点。研究发现基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP9)能够破坏血管内皮细胞胞外基质和血管基底膜,损伤毛细血管屏障功能。我们的前期动物实验也证实脓毒症状态下大鼠主动脉血管内皮层MMP9的表达会增高,而伴随着紧密连接蛋白(ZO-1,Claudin-5)表达的降低和毛细血管通透性的升高。而且,我们应用中药大黄灌胃大鼠能够保护其肠黏膜毛细血管内皮细胞,减轻肠组织毛细血管渗漏;增加功能毛细血管数量;并且扩张肠黏膜毛细血管,减少血栓形成,最终改善脓毒症大鼠肠黏膜的血供和氧供。但是,因为中药大黄本身是一个复合体,包含多种化合物,究竟是其中的哪个或者哪几个化合物对脓毒症等严重感染状态下的微血管起保护作用目前尚不明确。在前期研究工作中我们采用萃取技术粗提大黄,再利用色谱方法对大黄粗提物进行分离,得到了21个单体化合物。在此基础上,本研究利用Transwell小室建立单层人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)模型,检测大黄单体对单层HUVEC的通透性影响;以及对HUVEC增殖的作用和内皮细胞钙粘蛋白脱落的影响,挑选出大黄的有效单体。再应用实时定量PCR,Western blot以及免疫荧光方法检测大黄单体对血管内皮细胞钙粘蛋白:VE-cadherin和紧密连接蛋白:ZO-1,Occludin,Claudin-5的基因和蛋白表达以及细胞形态和蛋白表达强度的影响。最后通过检测Akt的磷酸化,Rac1的活化,肌球蛋白轻链(Myosin Light Chain,MLC)的磷酸化水平和VE-cadherin的蛋白表达强度来阐明大黄单体是否通过PI3K/Akt信号通路对Rac1进行调控,继而对细胞粘附连接蛋白及肌球蛋白磷酸化的调节作用来保护血管内皮屏障的信号转导机制。第一部分大黄单体对单层血管内皮细胞通透性及增殖的影响研究目的:检测大黄单体对单层HUVEC的通透性影响,以及对HUVEC增殖的作用和内皮细胞钙粘蛋白脱落的影响,挑选出大黄的有效单体并阐释其可能的作用机理。研究方法:采用人脐静脉内皮细胞,用Transwell小室建立单层HUVEC模型,随机分为正常对照组,MMP9组,21种大黄单体组,地塞米松组。其中大黄单体组再随分为1、10、50μmol/L三个亚组。MMP9组,大黄单体组,地塞米松组首先按照1mg/L终浓度在细胞培养液中加入MMP9刺激。大黄单体组同时给予大黄单体干预,21种大黄单体的终浓度分别为1、10、50μmol/L;地塞米松组同时给予10μmol/L的地塞米松干预;正常对照组按照MMP9组的加药体积,加入等量PBS作为阴性对照。各组加药完毕,于37℃、5%CO2细胞孵育箱继续培养24小时。用荧光光谱仪测量通过单层HUVEC异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluorescence of endocytosed fluorescein isothiocyanate(FITC)-dextran,FD40)的荧光强度反应前者通透性大小;HUVEC的增殖和细胞培养上清液钙粘蛋白的浓度分别用MTT和elisa方法检测。结果:(1)与正常对照组比较,MMP9显著增加了单层HUVEC的通透性(P<0.05);而地塞米松和1μmol/L的大黄单体:大黄酸、3,8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡萝卜苷亚油酸酯和大黄素及其混合物都显著改善了MMP9损伤的单层血管内皮细胞通透性(P<0.05)。(2)1μmol/L作用浓度的上述5种单体混合后促进了HUVEC的增殖,增殖率为6.6%;而浓度为10、50μmol/L的混合单体抑制了HUVEC的增殖,抑制率分别为7.9%和13%。(3)MMP9刺激后Transwell小室上、下层细胞培养液VE-cadherin蛋白浓度均显著升高,而用5种单体及其混合物(1μmol/L)或者DEX(10μmol/L)与MMP9共同干预后VE-cadherin蛋白浓度明显降低。结论:大黄单体:大黄酸、3,8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡萝卜苷亚油酸酯、大黄素通过促进HUVEC的增殖和减少胞外VE-cadherin的脱落改善了MMP9损伤的单层HUVEC的通透性。第二部分大黄单体对MMP9损伤的血管内皮细胞连接蛋白的保护作用研究目的:观察大黄单体对MMP9损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)钙粘蛋白:VE-cadherin,紧密连接蛋白:ZO-1,Occludin,Claudin-5表达的影响。研究方法:采用人脐静脉内皮细胞,建立单层HUVEC模型,随机分为4组:Control组、MMP9组、MMP9+大黄单体混合物(monomer mixture,MM)治疗组(MMP9+MM组)、MMP9+地塞米松治疗组(MMP9+DEX组);其中MMP9组按1mg/L终浓度加入MMP9刺激;MMP9+MM组在给予1mg/L的MMP9刺激的同时给予大黄5种单体干预:大黄酸,大黄素,3,8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸,1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖,胡萝卜苷亚油酸酯,每个单体作用的终浓度都是1μmol/L;MMP9+DEX组:按1mg/L终浓度加入MMP9刺激的同时给予10μmol/L的地塞米松治疗。Control组:按照MMP9组的加药体积,加入等量PBS代替药物作为阴性对照。继续培养24小时后,分别用实时定量PCR方法和Western blot方法检测钙粘蛋白:VE-cadherin,紧密连接蛋白:ZO-1,Occludin,Claudin-5的基因表达和蛋白表达,用免疫荧光方法检测血管内皮细胞的形态和上述连接蛋白的表达位置及强度。结果:(1)给予MMP9刺激以后,HUVEC钙粘蛋白:VE-cadherin,紧密连接蛋白:ZO-1,Occludin,Claudin-5的基因表达较Control组均有不同程度下降(P<0.001),其中VE-cadherin下降最明显。用MM或DEX和MMP9共同孵育下,上述4种连接蛋白的基因表达水平较MMP9组明显升高(P<0.001)。同时MMP9+MM组明显高于MMP+DEX组(P<0.001)。(2)MMP9刺激导致钙粘蛋白:VE-cadherin,紧密连接蛋白:ZO-1,Occludin,Claudin-5的蛋白表达明显下降,与control组,MMP9+MM组和MMP9+DEX组比较有显著差异(P<0.001)。MMP9刺激的同时再用MM干预上述4种连接蛋白的蛋白表达水平比用DEX干预明显升高。(3)正常组细胞形态规则、胞膜完整,绿色荧光标记的连接蛋白颗粒连续、结构清晰;MMP9刺激后连接蛋白的荧光颗粒显著减少,断裂,细胞形态结构模糊不清;而给予MMP刺激的同时用大黄单体或地塞米松干预后上述情况得到改善。结论:大黄酸、3,8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡萝卜苷亚油酸酯和大黄素五种单体能够升高内皮细胞的粘附连接蛋白和紧密连接蛋白的基因和蛋白表达,保护内皮细胞的形态和细胞间连接结构。第三部分大黄单体混合物改善血管内皮通透性的信号转导机制研究目的:通过检测大黄单体对PI3K/Akt-Rac1信号通路的影响,及肌球蛋白(Myosin light chain,MLC)磷酸化(p-MLC)的调节作用来阐释其保护血管内皮屏障的信号转导机制。研究方法:建立单层脐静脉血管内皮细胞模型,随机分为Control组,MMP9组,大黄单体混合物(monomer mixture,MM)组,地塞米松(dexamethasone,DEX)组,PI3K抑制剂wortmannin组,Rac1抑制剂组NSC23766(NSC)组共6个组。其中MMP9组、MM组、DEX组、wortmannin组和NSC组细胞培养液加入1mg/L的MMP9;MM组同时加入1μmol/L的大黄酸、3,8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡萝卜苷亚油酸酯和大黄素共同干预;DEX组同时加入10μmol/L DEX;wortmannin组加入1μmol/L的wortmannin;NSC组加入100μmol/L的NSC23766培养细胞24h。采用Rac1活性检测试剂盒检测Rac1的活性;Western blot方法检测AKT,p-AKT,VE-cadherin,MLC,p-MLC的表达。结果显示:(1)给予MMP9刺激以后Akt磷酸化(p-Akt)水平较正常对照组明显增高(P<0.001),给予MM、DEX或wortmannin干预后,能显著降低p-Akt(P<0.01)。但较正常对照组仍有一定程度的增高(P<0.01)。(2)MMP9组较正常组明显促进了Rac1的活性(P<0.001);应用MM、DEX或NSC干预均能降低Rac1的活性(P<0.01)。同时VE-cadherin的蛋白表达量增加,与MMP9组比较(P<0.05)。(3)MMP9刺激后MLC磷酸化水平较正常对照组明显增高(P<0.001),给予MM或DEX干预显著降低p-MLC(P<0.01)。但较正常对照组仍有一定程度的增高(P<0.01)。结论:大黄酸、3,8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡酰基-2-(4-羟基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡萝卜苷亚油酸酯和大黄素通过PI3K/Akt途径抑制Rac1的活化,一方面降低了粘附连接蛋白的损伤;另一方面降低肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化,抑制内皮细胞收缩。最终改善单层血管内皮细胞的通透性。