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研究证实,糖尿病(Diabete mellitus,DM)患者体内的高糖环境可造成非酶糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)在男性生殖道中大量积累,并与生精上皮、附睾及精子中表达的糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)结合,并导致男性生殖机能障碍。目前尚不清楚AGEs对睾丸间质(Leydig)细胞睾酮分泌的影响。本研究探讨了AGEs对大鼠Leydig细胞睾酮分泌的影响,并对其作用机理进行了初步研究,现将结果报告如下。 (1)体外培养原代大鼠睾丸Leydig细胞,采用RT-PCR、免疫荧光方法检测糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)在大鼠Leydig细胞中的表达;采用ELISA方检测不同浓度AGEs(25、50、100、200μg/mL)处理对Leydig细胞睾酮分泌的影响。结果表明,RAGE能在大鼠睾丸Leydig细胞上表达;hCG处理能显著促进睾酮合成(P<0.01);AGEs处理Leydig细胞后,hCG诱导的睾酮合成量呈现下降趋势,与hCG处理相比,用50、100、200μg/mL AGEs处理的Leydig细胞睾酮合成量分别降低26.2%、41.3%和51.4%(P<0.01)。 (2)采用不同浓度的AGEs(50、100、200 μg/mL)处理Leydig细胞,荧光定量PCR和Western-Blot检测睾酮合成关键蛋白(StAR、3β-HSD和P450scc)mRNA的转录水平及蛋白表达量。结果表明:AGEs处理细胞12 h后,StAR、3β-HSD和P450scc mRNA的表达量呈下降趋势,其中100 μg/mL AGEs处理组StAR、P450scc和3β-HSD mRNA的转录水平与对照组相比分别下降了16.4%、10.4%和11.6%,与对照组差异显著(P<0.05);200μg/mL AGEs处理组分别降低了45.8%、33.2%和18.7%,差异极显著(P<0.01)。AGEs处理Leydig细胞24 h后,StAR、3β-HSD和P450scc mRNA的转录均显著低于对照组(P<0.01)。Western-Blot结果表明经AGEs处理48小时后,与对照组相比,3β-HSD、P450scc和StAR的蛋白水平以剂量依赖方式降低,在200μg/mL的AGEs作用下,StAR、3β-HSD和P450scc分别下降了42.2%、35.9%和49.2%,均显著低于对照组(P<0.01)。 (3)为了证实氧化应激(Oxidative Stress,OS)和内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)在AGEs抑制睾丸间质细胞分泌睾酮中的作用,采用抗氧化剂NAC预处理Leydig细胞,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(Reaetive Oxygen Species,ROS)的含量。结果表明,NAC 能显著抑制 AGEs 引起的睾酮分泌下降(P<0.01);且随着AGEs浓度的升高,Leydig细胞内ROS含量随之增加,并呈现剂量依赖性,200μg/mL AGEs处理组ROS含量极显著地高于对照组1.61倍(P<0.01)。上述结果证实,AGEs通过OS抑制了Leydig细胞睾酮的分泌。 采用ERS抑制剂TUDCA预处理Leydig细胞后,TUDCA显著抑制AGEs引起的睾酮分泌下降(P<0.01)。Western Blot检测结果表明,随着AGEs浓度的升高,ERS标志性蛋白 CHOP 和 GRP78的表达水平显著升高(P<0.05),特别是经 200 μg/mL AGEs处理后,CHOP和GRP78蛋白的表达水平明显增高,分别是对照组的2.40倍和2.51倍,组间差异极显著(P<0.01),提示AGEs通过ERS抑制了睾酮的分泌。 (4)为了进一步探讨AGEs作用于Leydig细胞的信号通路,观察了Leydig细胞ERK1/2 蛋白磷酸化的变化情况。结果表明,经过 hCG 处理的Leydig细胞ERK1/2 蛋白磷酸化明显升高,是对照组的3.29倍,差异极显著(P<0.01),加入AGEs后,ERK1/2蛋白磷酸化下降,与hCG组相比,50、100、200μg/mL的AGEs处理组ERK1/2蛋白磷酸化水平分别比对照组显著下降了6.32%、28.8%和61.6%(P<0.01),且呈剂量依赖性。上述结果表明,AGEs可通过抑制ERK1/2信号通路影响Leydig细胞睾酮的分泌。 综上所述,RAGE可在大鼠睾丸Leydig细胞中表达,AGEs通过诱导OS、ERS、抑制 ERK1/2 信号通路等,抑制 Leydig 细胞中关键蛋白 StAR、3β-HSD 和 P450scc的表达,进而抑制睾丸Leydig细胞睾酮的分泌。本研究揭示了AGEs抑制大鼠Leydig细胞睾酮分泌的作用及机理,为防治糖尿病引发的男性生殖功能紊乱提供了理论依据。