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瞬时受体电位（Transient Receptor Potential,TRP）通道家族成员TRPV3是一种钙通透性、配体门控的非选择性阳离子通道。TRPV3通道作为一种温觉感受器,激活温度范围为33℃-39℃,其主要分布于人体的背根神经节、三叉神经节和皮肤角化细胞等中枢神经和外周感觉系统。研究发现,TRPV3通道不仅与温度感受相关,还与疼痛、瘙痒以及皮肤毛发生长等生理活动和病例有着密切的联系。虽然TRPV3通道与众多生理病理活动相关,但目前尚却缺乏特异性作用于TRPV3通道的工具药,使得TRPV3通道的药理学研究受到极大地限制。研究目的发展、优化高通量筛选TRPV3通道调节剂的方法,寻找TRPV3通道的特异性抑制剂。研究方法采用Flex Station 3仪器,通过优化表达TRPV3通道的HEK293T细胞密度、Cal-520钙荧光染料的孵育时间和浓度、以及TRPV3的非特异性激动剂2-APB/樟脑与钌红（TRPV3非选择性抑制剂）的加药先后顺序等四个条件,对高通量钙荧光筛选TRPV3离子通道调节剂的方法进行条件优化;运用抑制剂钌红,评价2-APB所致钙荧光信号的增强是否来自直接通过激活TRPV3通道;通过应用优化后的高通量筛选方法,筛选靶向TRPV3通道的天然调节剂;应用全细胞膜片钳记录进行活性确认及选择性评价;对天麻干燥的块茎运用减压加热回流、HPD100大孔吸附树脂、ODS柱、硅胶柱、HPLC高效液相色谱仪,结合正向、反向薄层色谱对天麻有效成分进行提取分离;采用优化的高通量筛选方法对天麻提取物进行靶向TRP通道的活性测定与评价。研究结果本研究成功建立并优化了高通量钙荧光筛选TRPV3离子通道调节剂的方法,得到的最佳筛选条件为细胞密度40,000个细胞/孔、Cal-520钙荧光染料浓度为5.0%、孵育时间为1.5 h、筛选TRPV3通道调节剂时应先加入抑制剂再加入待测化合物进行测试;运用优化的高通量钙荧光方法,测得钌红抑制TRPV3通道的半抑制浓度(IC50)为5.35±1.39mM,并从天然产物中发现了新的TRPV3通道抑制剂—甲基莲心碱。全细胞膜片钳记录实验测定甲基莲心碱抑制TRPV3通道的IC50为24.5±4.1mM。对通道的选择性评价表明,甲基莲心碱对TRPV1与TRPV4通道无明显的抑制作用。从天麻中分离得到了天麻素、5-羟甲基糠醛、对醛基苯基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷三种天然产物;初步活性筛选的研究结果表明,天麻初步分离的五种混合物以及天麻素对TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1以及TRPM8通道无明显的激活及抑制作用。研究结论本研究使用FlexStation 3仪器建立并优化了高通量钙荧光筛选TRP通道的方法,通过筛选发现了一种TRPV3通道的天然抑制剂—甲基莲心碱;全细胞膜片钳记录确认,甲基莲心碱对TRPV3通道具有浓度依赖的抑制作用,同时证明Flex Station 3钙荧光筛选方法在TRP通道调节剂高通量筛选的可行性;全细胞膜片钳电生理方法还证明,甲基莲心碱对TRPV1、TRPV4通道电流无抑制作用。从天麻初步分离的混合物的活性评价表面,天麻素对TRPV1-4,TRPA1以及TRPM8通道基本无调节作用。甲基莲心碱作为一种新的天然TRPV3通道抑制剂,其发现对TRPV3通道的药理学功能研究具有应用价值和意义。