研究背景与目的:力在骨改建过程中起着十分重要的作用,例如骨在长期负重情况下骨密度增加,而在失重环境中长期生活骨密度会发生一定程度的降低,导致骨质疏松。在口腔正畸临床治疗过程中,对骨施加压力使牙齿发生移位;种植治疗中通过渐进性负重促进骨小梁的形成都是利用力对骨改建的重要作用。体外实验研究中,成骨细胞通过感知压力作用,释放出多种细胞因子以调节成骨细胞与破骨细胞功能;而众多细胞因子的改变主要是通过细胞内部生物信号系统来调节细胞功能。成骨细胞受到机械应力刺激后产生调控成骨与破骨的效应,关联相当复杂的生物力学信号通路,其中促丝裂原激活蛋白激酶MAPK和AKT信号转导通路是细胞内部传递生物信号的重要途径,国内外已有大量实验证实MAPK和AKT信号通路中相关蛋白能够被机械刺激激活并调节成骨细胞功能。细胞内信号通路涉及的蛋白质众多,当细胞受到压应力刺激时这些信号通路是如何调节骨改建功能,其中的反应十分复杂。在不同加压条件下哪些蛋白酶被压应力刺激激活发挥作用,对机械力产生早期应答反应,从而导致不同的成骨或破骨效应,目前尚无实验进一步研究证实。因此本实验通过对三维培养的成骨细胞施加不同的压应力条件,采用磷酸化蛋白芯片技术检测相关蛋白因子磷酸化表达水平,以探讨压应力作用下细胞内相关信号通路激活情况。从而探究不同压应力作用下参与早期应答反应的相关信号通路,并筛选出压应力刺激早期应答中参与调控成骨细胞功能的关键信号因子。方法:1.制作细胞培养和压应力加载装置,利用本实验组自行制作的藻酸钙凝胶培养孔作为成骨细胞培养及加压装置;采用鼠尾I型胶原作为成骨细胞的三维培养基质。分别对成骨细胞施加2g/cm2、5g/cm2的压应力,持续加压6h,以不加力组(称为0g/cm2组)作为对照组。将加压后的细胞胶原,经罗丹明标记鬼笔环肽染色后共聚焦显微镜下观察细胞三维培养形态,采用CCK8法检测3组细胞的活性。2.对成骨细胞分别施加不同时间的压力,实验组为2 g/cm2、5 g/cm2,对照组0g/cm2,分别持续加压45 min、3h和6h。应用磷酸化蛋白芯片技术,检测不同压应力条件下MAPK以及AKT信号转导通路中相关蛋白磷酸化的表达水平。结果:1.对成骨细胞施加2 g/cm2、5 g/cm2压应力作用6 h后,通过罗丹明标记鬼笔环肽对成骨细胞MC3T3-E1的肌动蛋白染色,共聚焦荧光显微镜下观察,细胞附着点成立体分布于细胞培养基质中;采用CCK8法检测细胞活性,结果显示3组间的OD值差异无统计学意义(P>0.05)。2.持续施力6 h时2 g/cm2压应力CREB、AKT、HSP27、GSK3α、GSK3β、JNK、MSK2、p38、p53、p70s6k、ERK1/2磷酸化蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05);5g/cm2压应力时CREB、MSK2、p38、p53、p70s6k、ERK1/2磷酸化蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05);5 g/cm2时AKT、GSK3β与HSP27的磷酸化蛋白表达量明显低于2 g/cm2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 g/cm2组持续作用45 min和3 h时,各蛋白磷酸化表达水平与对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。压应力为5g/cm2时,持续作用45min,p70s6k磷酸化蛋白表达水平明显高于对照组(P=0.038<0.05);RSK1在5g/cm2组磷酸化蛋白表达水平显著低于对照组(P=0.019<0.05)。5g/cm2持续作用3h时HSP27、p70s6k和RSK2的磷酸化蛋白表达水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);其他磷酸化蛋白表达水平与对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.本实验设计的压应力加压装置及实验条件能够维持成骨细胞三维培养形态,压应力加载条件不会影响成骨细胞活性。成功建立的压应力加载模型,可作为压应力相关研究的实验平台。2.细胞持续加压6 h是相关信号通路对压应力产生早期应答反应的关键时间点。3.压应力作用下成骨细胞早期应答反应中相关信号通路的激活与压应力的大小有关。压应力分别持续作用45min和3 h,较重的压应力5 g/cm2能够比2 g/cm2在更早期使部分蛋白发生变化;在细胞受压6 h,较轻压应力2 g/cm2比5 g/cm2组能更广泛地激活相关信号通路参与早期骨应答反应。4.p70s6k可能是本实验模型中参与调控早期骨应答反应的关键蛋白激酶,但其具体作用机制仍需进一步研究探讨。