论文部分内容阅读
目的椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）是指椎间盘失去正常结构并伴有进行性纤维化,表现为凝胶样髓核消失,髓核与纤维环原有清晰界限逐渐消失,纤维环板层粗糙和纤维化,最后出现裂隙及老年色素沉积。研究证实椎间盘的退变与椎间盘组织中酶系活性的改变和某些细胞因子的释放有关。多效生长因子（pleiotrophin,PTN）及血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）是血管生成的重要刺激因子,在椎间盘退变中的作用仍不十分清楚,本文研究不同月龄Wistar大鼠腰椎间盘形态学变化规律和其中PTN及VEGF含量的变化情况,以阐明生理状态下大鼠腰椎间盘中PTN及VEGF表达的变化趋势,进一步探讨PTN及VEGF与腰椎间盘退变的关系。材料与方法1、实验动物的分组及标本采集健康Wistar大鼠共50只,雄性,体重不限,以月龄为单位,分为1、3、6、12和18,5个实验组,每组10只。以25g/L戊巴比妥钠腹腔过量麻醉处死大鼠,每只大鼠取第4、5腰椎间盘组织标本。第5腰椎间盘标本取出后经4%多聚甲醛溶液固定,10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脱钙,石蜡包埋,4μm连续切片;第4腰椎间盘标本置于-70℃冰箱保存。2、实验方法（1）HE染色二甲苯脱蜡→梯度酒精水化→苏木精-伊红染色→梯度酒精脱水→二甲苯透明→树胶封片;（2）SABC免疫组织化学染色脱蜡水化→3%过氧化氢（H2O2）抑制内源性过氧化物酶活性→热抗原修复→BSA封闭→一抗、二抗孵育→滴加SABC试剂→DAB显色→核复染→1%盐酸酒精分化→脱水透明→树胶封片;同时选用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。（3）Western-blot免疫印迹染色将组织碾碎→超声匀浆、离心,提取蛋白,蛋白定量,加样→SDS-PAGE凝胶电泳→转膜→封闭、洗涤后在一抗溶液中4℃浸泡过夜→二抗溶液中室温下浸泡2小时→洗涤液洗膜后染色至条带呈现,终止染色。同时选用β-actin作内参,PBS代替一抗作为阴性对照。（4）结果判定PTN及VEGF主要定位于细胞浆,以椎间盘细胞胞浆内出现棕黄色染色颗粒定为阳性,按阳性细胞百分比进行分析。Western-blot试验结果条带用凝胶图象分析系统进行灰度值分析。（5）数据分析数据资料以均数±标准差（（?）±s）表示,并采用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析,P＜0.05为有统计学意义。结果1、HE染色结果随着大鼠月龄的增加,椎间盘组织结构紊乱的程度逐渐加重,髓核内基质降解、正中出现空腔,胶原纤维增生、粗大、排列紊乱、并可见纤维断裂或缺失。2、PTN及VEGF的表达情况随着大鼠月龄的增加（1-12月龄）,椎间盘组织细胞中PTN及VEGF的表达有逐渐减低的趋势,但至18月龄,PTN及VEGF的表达又有所增加;6和12月龄组椎间盘细胞中PTN及VEGF的表达显著低于1月龄组（P＜0.01）,而18月龄组PTN及VEGF的表达显著高于12月龄组（P＜0.01）。同月龄组椎间盘细胞中,PTN及VEGF在终板的表达高于在髓核和纤维环中的表达（P＜0.05）,髓核和纤维环中PTN及VEGF的表达未见明显差异（P＞0.05）。部分标本细胞外基质中也可见PTN及VEGF阳性表达。结论1、大鼠椎间盘组织结构随着月龄增加逐渐发生退行性变;2、PTN及vEGF参与了大鼠椎间盘的退变,并可能通过促进椎间盘组织中新生血管的形成,延缓和修复椎间盘的退变。