恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一，人类一直都在探索对肿瘤有效的治疗方法，寻找新的高效低毒的抗癌药物仍是当务之急。近年来随着分子肿瘤学的研究进展，人们发现有可能通过阻断肿瘤细胞中特定的分子机制起到杀灭肿瘤的作用，从而出现了以分子机理为出发点的(mechanism-oriented)筛选策略，这有助于的发展选择作用强而副作用低的抗癌药物。 本研究对各化合物的构效关系进行了讨论，对13号化合物(硫杂斑蝥素)对PP2A酶的作用特点以及其抑瘤作用的机制也进行了探讨。 [方法与结果] 一：斑蝥素类似物抗肿瘤细胞增殖作用 方法：取对数生长期的MGC803、HepG2、KB-3-1、HL-60、GLC82肿瘤细胞接种于96孔板，每种化合物均设不同浓度的用药组及相应的溶剂对照组。MTT法检测每孔OD值，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50值)。 结果：在所筛选的13种化合物中，13号化合物(硫杂斑蝥素)表现较强的细胞毒作用，对MGC803、HepG2、KB-3-1细胞的IC50值分别为1.3±0.1μM、14.7±7.0μM、1.8±0.2μM。对各种肿瘤细胞的IC50值与先导化合物斑蝥素接近；9和11号化合物也表现出一定的细胞毒作用，对部分肿瘤细胞株的IC50值与去甲斑蝥素接近；12号化合物仅对KB-3-1细胞有轻度的毒性；而其他化合物均未表现出明显的细胞毒作用(参看Table1)。 二：斑蝥素类似物对PP2A酶的抑制能力及构效关系分析 方法：利用孔雀石绿测定法(Malachitegreenassay)测定斑蝥素类似物对PP2A的抑制能力；同时相应测定其对PP1的抑制能力，了解化合物对PP2A的选择性。 结果：在所筛选的13种化合物中，13号化合物表现出较强的PP2A抑制活性，对PP2A抑制的IC50值为2.11±0.26μM；9、11号化合物也表现出对PP2A有效的抑制作用，对PP2A抑制的IC50值分别为23.4±5.4μM，34.4±4.3μM。12号化合物表现相对较弱的抑制活性，对PP2A的IC50值为62.2±10.1μM。而其他化合均未表现出明显的细胞毒作用。同斑蝥素和去甲斑蝥素相比，9、11、12、13号化合物在对PP2A的选择性上无特别突出表现(参看Table2)。1-C位置上添加侧链基团的第1类改造后的斑蝥素类似物丧失了对各肿瘤细胞株的抗增殖作用，同时也不具备对PP2A的抑制活性；9号化合物具有一个开环的内酯结构，11号化合物具有一个不对称的开环碳酐结构，具有一定的抗肿瘤细胞增殖作用及对PP2A的抑制活性；7号、10号化合物分别是9、11号化合物的闭环结构形式，抗肿瘤细胞增殖作用不明显，也不具备对PP2A的抑制活性。具有硫杂碳酐结构的13号化合物仍具有较强的细胞毒作用，其对PP2A的抑制活性在新合成的化合物中也是较突出的。 三：斑蝥素类似物对细胞内PP2A酶的影响及酶动力学特性 方法：9、11、13号化合物以及斑蝥素处理MGC803细胞24h后，利用PP2A免疫沉淀法将MGC803细胞裂解液内的PP2A粗提，收集于固相的ProteinA琼脂糖微珠上，再利用孔雀石绿测定法(Malachitegreenassay)测定其活性。 MGC803细胞同13号化合物共同孵育24h后，用Westernblot法测定细胞内PP2Ac催化亚基及PP2A/Aβ结构亚基的含量，并同斑蝥素和/或去甲斑蝥素等已知的PP2A抑制剂进行了对照。 利用孔雀石绿测定法(Malachitegreenassay)测定磷酸化多肽(K-R-pT-I-R-R)底物经PP2A脱磷酸反应释放出的自由磷酸盐含量，计算出底物脱磷酸反应的速率(pmol/h)，利用反应速率-底物浓度双倒数作图法，观察斑蝥素和13号化合物(硫杂斑蝥素)作用于PP2A的酶动力学特点。 结果：使用9、11、13号化合物以及斑蝥素处理MGC803细胞后，均使胞内的PP2A活性受到一定程度的抑制，并且呈剂量依赖性的关系； 而MGC803细胞经13号化合物以及斑蝥素处理24h后，Westernblot法未发现胞内PP2Ac催化亚基的含量有明显可见的变化；13号化合物以及斑蝥素、去甲斑蝥素和冈田酸等PP2A抑制剂处理MGC803细胞24h后，胞内PP2A/Aβ结构亚基的含量也未发现明显可见的变化。 酶动力学检测结果显示不同浓度的斑蝥素和13号化合物作用下的反应速率-底物浓度双倒数直线都相交于横坐标上一点，说明其反应的米氏反应常数(Km)是不受影响的，而最大反应速度(Vmax)随抑制剂浓度增加而下降，斑蝥素和13号化合物(硫杂斑蝥素)对PP2A酶呈非竞争性抑制作用。 四：斑蝥素类化合物对肿瘤细胞周期及凋亡的影响 方法：利用流式细胞仪检测斑蝥素及类似物对肿瘤细胞周期的影响，利用流式细胞仪及DNA琼脂糖凝胶电泳检测斑蝥素类似物作用于MGC803细胞后凋亡特征的出现。WesternBlot检测斑蝥素类似物对于MGC803细胞内Cdc25C、Cdc2和CyclinB1蛋白表达的影响。 结果：13号化合物在作用24h后可引起MGC803细胞G2/M期的阻滞，并在作用48h后出现较明显的凋亡(参看Table4和Table5)。DNA琼脂糖凝胶电泳可检测出具有凋亡特征性的“梯状”DNA断裂片段。斑蝥素、去甲斑蝥素以及PP2A的经典抑制剂冈田酸可更加明显的引起这一现象；而相应由DDP引发细胞凋亡前则未出现明显的G2/M期阻滞；说明这一类的PP2A抑制剂有可引发细胞周期G2/M期阻滞的特点，随后发生的凋亡可能与此有关。WesternBlot检测未发现13号化合物、斑蝥素、去甲斑蝥素及冈田酸处理MGC803细胞24h后细胞分裂周期相关蛋白CDC25c和CDC2表达量的变化，但发现去甲斑蝥素和冈田酸可引起CyclinB1蛋白表达的下调，而13号化合物及斑蝥素这一作用不明显。 五：13号化合物(硫杂斑蝥素)体内抗肿瘤作用 方法：13号化合物(硫杂斑蝥素)的小鼠急性毒性实验目测观察估计LD50值；腹腔给药观察对于小鼠腋下接种的艾氏腹水癌(EAC)瘤株生长的抑制状况。 结果：对于小鼠腋下接种的艾氏腹水癌(EAC)瘤株，13号化合物(硫杂斑蝥素)在0.2mg/kg组、0.4mg/kg组未表现出有统计学意义的抑瘤作用；在0.8mg/kg组中三次测得的抑瘤率分别为30.0％(P＜0.05)、34.6％(P＜0.01)和30.3％(P＜0.05)，在1.6mg/kg组中二次测得的抑瘤率分别为49.0％(P＜0.01)和38.5％(P＜0.01)，在2.4mg/kg组中测得的抑瘤率为46.7％(P＜0.01)，呈现出体内抑瘤作用；但在2.4mg/kg组中小鼠体重增长较对照组明显减慢，该组共10只小鼠中有3只小鼠死亡，显示一定毒性作用，而在3.2mg/kg组中部分小鼠出现精神萎靡、反应迟钝、行动缓慢、活动减少、毛发蓬松，最终该组共10只小鼠中有5只小鼠死亡，表明该化合物在3.2mg/kg/日的剂量下已经呈现明显的毒性作用。 [结论] 1.在对MGC803(人胃腺癌)、HepG2(人肝细胞癌)、KB-3-1(人口腔鳞癌)、HL-60(人早幼粒白血病)和GLC82(肺腺癌)细胞体外抗增殖活性测定中，发现具有自由羧酸开环结构的9、11号化合物及硫杂碳酐结构的13号化合物表现出细胞毒作用，尤其以13号化合物(硫杂斑蝥素)明显。 2.在13个合成的斑蝥素类似物中，具有自由羧酸开环结构的9、11号化合物及硫杂碳酐结构的13号化合物具有PP2A的抑制活性；而在1-C位附加侧链的化合物均失去对PP2A酶的抑制活性。各化合物的细胞毒作用同其对PP2A的抑制能力表现出关联性。 3.9、11、13号化合物及斑蝥素作用MGC803细胞后，胞浆内PP2A的活性有可检测到的下降，并呈剂量依赖关系；而13号化合物及斑蝥素并未引起细胞内PP2Ac亚基和Aβ亚基明显可见的变化，说明该类化合物抑制细胞内PP2A的活性，但并不影响到PP2A核心酶蛋白的表达。 4.酶动力学测定显示13号化合物对PP2A呈非竞争性抑制作用，与斑蝥素具有同样的特点。 5.13号化合物可引起MGC803细胞发生G2/M期的阻滞以及随后的凋亡，斑蝥素、去甲斑蝥素以及PP2A的经典抑制剂冈田酸可更加明显的引起这一现象；而DDP引发细胞凋亡前则未出现明显的G2/M期阻滞；这表明斑蝥素类化合物对细胞周期的影响与其细胞毒作用有关。本次研究发现去甲斑蝥素和冈田酸可引起CyclinB1蛋白表达的下调，与细胞的G2/M期阻滞可能有关，而13号化合物(硫杂斑蝥素)及斑蝥素在给定浓度下这一作用不明显。 6.推测除了PP2A外，13号化合物(硫杂斑蝥素)可能尚有其他作用靶点。 7.体内抑瘤实验表明13号化合物(硫杂斑蝥素)具有一定的抗肿瘤活性，但安全范围较窄，有待进一步改进。