幽门螺杆菌(H.pylori)是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病原菌,且与胃癌的发生密切相关。现已有许多研究致力于探讨H.prlori致病相关的细菌、宿主和环境因素之间的交互作用。其中,鉴定病原菌的毒力株和毒力蛋白是微生物致病机理研究的基本策略。Enroth等采用2-DE和免疫印迹技术对来自胃炎、十二指肠溃疡和胃癌患者的不同H.pylori临床分离株进行蛋白质组学研究,结果提示不同类型胃疾病的H.pylori菌株蛋白质组中存在疾病特异性蛋白。　　 目前研究发现,与H.pylori菌株致病性有关的基因位点主要为细胞毒素相关基因(CagA)及空泡毒素相关基因(VacA)等。国外报道,感染CagA阳性或VacA多念性变异的H.pylori菌株可以提高胃癌发生风险。除了Caga,VacA外,近年来有学者陆续报道一些功能未知或尚未鉴定的菌株特异性基因位点也可能与H.pylori相关性胃疾病的发生发展密切相关。前期,该室通过抑制消减杂交(SSH)和斑点杂交的方法建立胃癌相关幽门螺杆菌差异基因文库,对差异基因进行筛选挑出11个与胃癌相关的高拷贝基因序列,证实了其中HPSH_05790在胃癌患者来源的菌株L301及浅表性胃炎患者来源的菌株B975的基因中存在拷贝差异。目前,该差异基因的具体功能尚不清楚。KEGG数据库报道其蛋白结构域中包含peptidyl-prolyl cis-trans isomerase功能域,即肽基-脯氨酰-顺反异构酶(PPIase),其被证实在嗜肺军团菌中具有毒力因子特征。　　 本研究通过构建胃癌相关差异基因幽门螺杆菌HPSH_05790真核表达质粒,并转染3种胃细胞系AGS、SGC7901、GES-1观察重组蛋白对细胞的增殖效应和细胞周期的变化。为进一步探索疾病相关H.pylori菌株的致病机制,寻找具有针对性的治疗靶点提供实验工具和研究线索。　　 材料和方法：　　 一、细胞系、菌株和质粒人胚肾AD293细胞系、胃腺癌AGS细胞系购自ATCC。人胃上皮细胞株GES-1来自北京市肿瘤防治研究所细胞遗传室。人胃腺癌细胞系SGC-7901和H.pylori菌株及DNA来自中国医科大学肿瘤研究所肿瘤病因与筛查研究室。DH5a感受态细菌购自TaKaRa公司。pcDNATM3.1/myc-His(-)质粒:由美国西弗吉尼亚大学医学院生理/药理学系刘军副教授赠与。　　 二、实验方法　　 (一)HPSH_05790基因真核表达质粒的构建及其表达产物的鉴定以胃癌及胃炎来源的幽门螺杆菌DNA为模板,根据差异基因HPSH_05790序列和pcDNATM3.1/myc-His(-)载体多克隆酶切位点设计引物,PCR扩增产物及pcDNATM3.1/myc-His(-)同时用EcoRI、BamHI双酶切连接后转化大肠杆菌DH50α,筛选阳性克隆,抽提质粒去内毒素并测序,与GeneBank中HPSH_05790序列比较同源性。并通过Western Blot方法对表达产物进行鉴定。　　 (二)细胞培养及转染SGC-7901、GES-1、AD293和AGS分别在含有20％胎牛血清的RPMI1640培养基、DMEM培养基,F12培养基中培养中培养(37℃,5％CO2)。将各类细胞接种在6孔板里,待细胞密度达到90％左右,用无血清的培养基饥饿2h后,分别转染:以L301、26695菌株为模板构建的HPSH_05790重组质粒,以转染空质粒,和未转染的细胞为对照。转染用试剂LipofectamineTM2000,具体操作步骤按说明书进行。取各实验组及对照组细胞,进行细胞增殖和细胞周期检测。　　 (三)细胞增殖和细胞周期检测　　 1、CCK-8法检测细胞增殖能力取转染后的胃癌细胞悬液进行细胞计数,分别接种于3个96孔板培养板。第24、48、72小时分别加入10ulCCK-8溶液,继续37℃孵育2-4小时后选择波长450nm在酶联免疫(ELlsA)检测仪上测定各孔吸光度。　　 2、流式细胞仪检测细胞周期变化收集对数生长期细胞制成5×105个/ml细胞悬液。1000rpm离心5min,弃上清。PBS洗涤一次,弃上清,重新悬浮于75％冰乙醇中,4℃固定过夜、离心后制成400ul的细胞悬液,加碘化丙淀染液(PI)于37℃避光孵育30分钟后,流式细胞仪检测,ModFitLT3.0软件分析细胞周期。　　 3、统计分析　　 所有计量资料以均数±标准差(Mean±SD)描述,每组实验至少重复3次,采用单因素方差分析。所有统计分析均采用SPSS16.0统计软件完成,以P＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 1、胃癌相关差异基因HPSH_05790基因真核表达质粒的构建及其表达产物的鉴定目的基因PCR、重组质粒EcoRI/BamHI双酶切电泳鉴定,产物为560bpDNA片段,与理论片段大小一致。DNA测序结果表明融合区域的读码框正确。Blast比对序列同源性好。体外转染AD293细胞48h Western Blot结果证实该蛋白可以正常表达。　　 2、HPSH_05790重组子瞬时转染3种不同胃细胞系,观察其增殖作用和细胞周期变化情况CCK-8法比较重组蛋白对3个胃细胞系AGS、SGC7901、GES-1增殖作用的影响,发现在两个胃癌细胞系AGS、SGC7901中,细胞较正常胃粘膜上皮细胞系有增殖趋势,尤其是AGS细胞系,但均无统计学意义。观察3种细胞系瞬时转染后的细胞周期变化,发现在转染效率较高的AGS细胞系,两重组蛋白组S期(％)26.927(±2.445),25.683(±2.83)较其他组21.227(±0.813),21.243(±1.71)增高,有统计学意义。因此,推测该蛋白可能与细胞增殖相关。　　 结论：　　 1、成功构建HPSH_05790真核表达质粒。　　 2、重组质粒瞬时转染AGS细胞系后S期增高,推测其可能与细胞增殖相关。