珙桐又名鸽子树,是我国特有的一级保护珍稀濒危植物,第三纪古热带植物孑遗种,具有很高的学术研究价值和观赏价值。其种子繁殖能力弱,自然更新困难,休眠期长,对生长环境要求苛刻。种子败育严重是制约珙桐有性繁殖的重要原因之一,这种现象在许多木本植物中是普遍存在的。目前对于这种自发的种子败育机制缺乏分子水平上的解释。本实验前期通过转录组测序,已建立珙桐果实和种子的unigene库,以上述unigene库作为参考序列,通过数字表达谱分析,在珙桐正常种子和败育种子中筛选出2361个差异表达基因。其中我们发现纤维素合酶基因(CesM)在败育种子中较正常种子呈现一致的显著上调表达。本实验通过分析纤维素合酶基因在珙桐种子发育过程中的表达模式,结合纤维素含量的测定,初步研究了珙桐中纤维素合酶的活性变化规律及在种子发育过程中所行驶的功能。并进一步选择了一个基因,通过对该基因的表达分析,克隆,蛋白表达和功能验证进一步明确该基因的功能。本研究旨在挖掘珙桐基因资源,解析种子败育的分子机制,为理解种子自发败育的生物学意义提供理论基础。主要研究内容如下:1.珙桐纤维素合酶基因的转录组数据分析在珙桐种子转录组数据库中筛选出14个纤维素合酶基因(CesA),共有22个转录本,在败育种子中呈现一致的显著上调表达。其中有7个基因在正常种子和败育种子中表达差异显著。2.纤维素合酶基因的表达分析qPCR检测表明CesM基因在败育种子中呈现一致的显著上调表达,挑选4个在败育种子中显著上调的CesM基因进行表达分析,结果表明它们表达模式相似,在败育种子中表达量均显著高于正常种子,且在正常种子发育后期上调表达。将表达差异最显著的c43681.graph_c0基因在珙桐不同组织中进行表达分析,结果显示c43681.graph_c0基因在花和果实等生殖器官中表达量较高,在叶和芽等营养器官中表达量较低,在败育的种子中表达量最高。证明c43681.graph_c0基因在生殖器官中偏好表达。3.c43681.graph_c 基因的克隆及编码产物特征分析设计引物将序列c43681.graph_c0基因进行克隆获得882bp片段,经序列分析,其编码产物包含292个氨基酸,具有6个跨膜结构域,等电点为9.07,为碱性蛋白,与拟南芥纤维素合酶4号催化亚基同源性最高,含有在植物中特有的保守区域。4.目标基因表达蛋白质将成功构建的pET28/CesA重组质粒导入宿主大肠杆菌BL21中进行原核表达,使用SDS-PAGE电泳进行分析。通过对诱导条件的摸索,诱导时间为4 h、IPTG诱导浓度为1 mmol/L时,纤维素合酶基因的表达量最大。5.基因功能验证将成功构建的pBI121/CesA重组质粒导入宿主农杆菌中,利用花序浸染法将目标基因转化拟南芥,利用含有卡那霉素的培养基对收获的种子进行初步筛选,观察转入目标基因的拟南芥植株的发育及第二代种子败育情况。实验证明,未成功转入目标基因的植株也能出芽,但是在未长出真叶之前就会白化进而死亡。