由青枯菌(Ralstonia solanacearum)所引起的青枯病是造成全球马铃薯种植产业损失最主要的细菌性病害。为深入了解青枯菌效应蛋白的致病机理,加快马铃薯与青枯菌的互作研究进展,我们建立了酵母筛选系统来研究青枯菌效应蛋白在马铃薯中的靶标蛋白,以此挖掘马铃薯中的互作抗病基因或感病基因。本课题详细研究结果如下:1.效应蛋白双杂交文库构建及马铃薯青枯菌响应候选关键蛋白互作靶标筛选:a)根据蛋白组研究发现,相比III型分泌系统突变体,马铃薯接种野生型青枯菌后体内部分蛋白出现显著下调。我们构建了包含52个UW551青枯菌效应蛋白的酵母双杂交筛选文库,用于研究下调蛋白与效应蛋白之间的关系。b)我们利用马铃薯的青枯菌响应候选关键蛋白基因构建诱饵蛋白,筛选效应蛋白双杂文库,发现文库中的Rip17效应蛋白与马铃薯候选蛋白磷酸酶StPP1存在相互作用,随后利用点对点酵母双杂实验验证了两者之间的相互作用。c)为了进一步研究Rip17效应蛋白与马铃薯磷酸酶StPP1的互作关系,我们进行了激光共聚焦的显微观察。结果发现,当分别单独表达时,效应蛋白Rip17定位于细胞核的核质区域,而StPP1蛋白则主要定位于在细胞核的核仁区域。当共同表达Rip17与StPP1蛋白后,发现StPP1在核仁区域的信号消失了,说明定位发生了迁移。Rip17的出现改变了StPP1蛋白原本的空间位置,暗示Rip17与StPP1存在相互作用。2.酵母生长抑制筛选文库构建及Rip25互作蛋白筛选:a)为了研究对酵母具有毒力功能的效应蛋白的互作靶标,我们构建了酵母cDNA生长抑制筛选文库。在诱导表达毒性效应蛋白后酵母会出现生长抑制,我们将通过遗传学手段来探索效应蛋白在酵母中的靶向关键蛋白或者作用通路。我们成功构建了酵母的生长抑制筛选组成型表达文库,文库总容量达到1.25*10^~7CFU。b)我们利用青枯菌的Rip25毒力效应蛋白对酵母cDNA文库进行了筛选,结果发现酵母内源ScHMO1蛋白能使Rip25介导的酵母生长抑制表型缺失。同时酵母体内降解实验显示,诱导表达Rip25效应蛋白后,酵母内源ScHMO1的蛋白条带减弱。c)为了验证ScHMO1及其在马铃薯中的同源基因能否恢复Rip25介导的本氏烟草细胞死亡表型,我们在本氏烟草中共表达Rip25与ScHMO1及其在马铃薯中的同源基因(StHMO2与StHMO7)。本氏烟草瞬时表达结果显示,ScHMO1和StHMO2无法恢复Rip25介导的本氏烟草细胞死亡并且在一程度上有所加重,然而StHMO7可在一定程度上恢复本氏烟草细胞死亡表型。暗示ScHMO1及其同源基因编码蛋白参与了Rip25介导的细胞死亡通路,但其中的作用机制仍有待进行验证。本课题构建了效应蛋白酵母双杂交文库和酵母生长抑制筛选文库,通过酵母双杂交技术获得了Rip17效应蛋白在马铃薯中的互作蛋白,利用酵母生长抑制筛选体系获得了Rip25效应蛋白在酵母中的靶标蛋白并展开验证。这为阐明青枯菌与马铃薯的互作机制奠定基础,同时将为马铃薯抗青枯病分子育种及遗传改良提供良好的基因资源。