平邑甜茶新根细胞死亡及其抗凋亡基因的表达研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zdjige
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平邑甜茶(Malus hupehensis(Pamp)Rehd.var pinyiensis Jiang)是我国特有的苹果砧木。本研究以平邑甜茶为试材,结合苹果基因组数据库http://genomics.research.iasma.it/,克隆了平邑甜茶MhBI-1基因的完整编码区序列,分析了其基因序列与编码蛋白的性质和功能,并成功构建了MhBI-1基因正反义表达载体;同时获取了苹果MdBI-1s家族基因序列,研究了它们在苹果不同品种、不同组织以及在平邑甜茶根不同生长时期及高温胁迫下的表达情况。此外,还研究了平邑甜茶新根(延长根和吸收根)抗凋亡基因MhBI-1、MhBAG、MhHSP70在正常管理、2,4-D及干湿交替作用下的表达情况。主要结果如下:1)获得了平邑甜茶MhBI-1基因,该基因编码区序列长747bp,编码248个氨基酸,GenBank登录号为KC456613。2)获得了苹果MdBI-1s家族基因,该基因家族共有10个基因,构建了该基因家族系统进化树,并对其表达特征进行了半定量测定。半定量RT-PCR结果表明,MdBI-1s表达有一定的相似性,在茎中的表达高于叶和根;在新疆野苹果中的表达高于山定子、平邑甜茶和八棱海棠。在幼苗阶段,随生长时间,MdBI-1s表达呈现先上升后下降趋势,六叶龄期时达到高峰;42℃高温胁迫下,MdBI-1s表达随胁迫程度的加剧呈现先上升后下降趋势,2h时到达高峰。3)构建了pET-30a-MhBI-1原核表达载体,进行了原核表达试验,测定MhBI-1蛋白大小约为25kD。4)构建了pBI121-MhBI-1正反义表达载体,通过花序侵染法转化拟南芥得到T0代种子。5)正常生长时,吸收根细胞死亡率及相关代谢活性:根系活力、ATP含量和类caspase3/7活性变化呈现波动性,相对于延长根,其水平高且变化频率快,抗凋亡基因MhHSP70、MhBI-1和MhBAG在吸收根中表达也呈现相似的特点,反映了吸收根生命周期短,更新速度快与代谢活跃的特点。延长根变化相对稳定,呈现“台阶式变化”,活跃期后呈现出生长抑制阶段,在这个过程中,延长根MhHSP70、MhBI-1基本处于被抑制状态,MhBAG出现了明显的表达高峰,这可能与延长根的生长状态有关。6)在2,4-D及干湿交替作用下,新根出现了细胞死亡率及类caspase3/7活性升高,ATP含量及根活力下降,抗凋亡基因表达升高的趋势。抗凋亡基因的高表达有利于减少细胞凋亡的发生;在抗凋亡基因表达高峰时,延长根抗凋亡基因升高倍数明显高于吸收根,暗示延长根有更好的抗凋亡能力。在2,4-D处理早期,吸收根细胞死亡率的上升倍数与根系活力的下降幅度均高于延长根;干湿交替作用过程中,复水后延长根细胞死亡率变化相比吸收根呈现滞后性,这些说明吸收根对2,4-D和干湿交替的反应比延长根灵敏。
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