论文部分内容阅读
肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,Ex PEC）是一类能够定殖于宿主肠道外组织并引发疾病的病原。其能够导致败血症、脑膜炎、肺炎、腹膜炎及肾盂肾炎等,往往预后不良。该菌群耐药情况复杂,对畜禽养殖行业影响巨大,严重威胁着食品安全、公共卫生与生态环境。细菌性脑膜炎是Ex PEC引起的主要病症之一。对于人类患者,该病死亡率较高,即便幸存也多遗留不同程度的神经系统后遗症,严重影响之后的生活质量。而在畜牧生产中,患畜则基本丧失进一步治疗的价值,由此产生较大的经济损失。Ex PEC引发脑膜炎依赖于其与血脑屏障（Blood-brain Barrier,BBB）的相互作用。而BBB作为一个由多细胞组成的复杂结构,其内部各类细胞间正常的相互交流、调控对屏障本身乃至中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）的结构与功能都具有重要意义。作为BBB主要组成之一的脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs）,其决定了BBB低通透性和CNS免疫豁免的特性,维持着神经系统内环境的稳态。长期以来,Ex PEC与BMECs的相互作用一直是细菌性脑膜炎研究过程中的重点,但以往这类研究多着眼于细菌与单层BMECs的相互作用,而忽略BMECs与屏障内其他类型细胞（如胶质细胞）的细胞间通讯在感染条件下的改变以及这样的改变对BBB甚至CNS功能的影响。因此,本研究拟从BBB内细胞间通讯角度对Ex PEC致病机制进行探讨,在解析BBB内细胞间通讯分子机制的前提下,对相关细胞间通讯在Ex PEC感染条件下的改变、意义及涉及的病原和宿主关键靶点进行探究。本研究所得研究结果如下:1、发现了星形胶质细胞来源的TGFβ1通过激活BMECs中非经典Hedgehog信号促进BBB屏障功能。本研究首先建立了基于transwell的体外BBB模型。通过将U251细胞和人源BMECs细胞共培养,结合已有的U251转录组数据,本研究发现星形胶质细胞来源的TGFβ1能够作用于BMECs细胞,并提高其紧密连接蛋白ZO-1的表达,从而提高内皮细胞的屏障功能。随后的体内和体外研究显示,TGFβ1能够通过激活的内皮细胞TGFBRI/II-Smad2/3信号调节ZO-1表达,但转录因子Smad2/3不能直接结合于zo-1基因启动子区域。进一步探究的结果显示,BMECs中的Smad2/3信号能够激活胞内非经典的Hedgehog（HH）信号,上调其转录因子Gli2表达,而Gli2则能够结合于zo-1基因启动子促进其表达。通过荧光素酶报告系统和染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）,本研究鉴定了Smad2/3与gli2启动子区域以及Gli2与zo-1启动子区域的结合位点。由此可以认为,星形胶质细胞所分泌的TGFβ1能够引发BMECs中非经典HH信号的激活以提升紧密连接蛋白ZO-1的表达,最终提高BBB的屏障功能。2、揭示了致脑膜炎Ex PEC分泌的α溶血素通过干扰上述基于TGFβ1的“胶质-内皮”细胞间通讯破坏BBB。本研究以致脑膜炎Ex PEC菌株RS218建立体内和体外感染模型,发现RS218感染能够下调BMECs上述TGFBRI/II-Gli2-ZO-1信号中的TGFBRII和Gli2蛋白,从而对星形胶质细胞与BMECs间基于TGFβ1的细胞间通讯产生干扰。生物信息学分析显示,RS218通过下调TGFBRII的正向转录调控因子Sp1抑制TGFBRII的表达。而当在感染过程中对Sp1进行过表达时,TGFBRII的下调则被回补。同时,本研究借助以Tn5-mini转座子构建的RS218突变体库,靶向gli2基因启动子筛选,鉴定到RS218中hly CABD操纵子是细菌下调内皮细胞中Gli2表达的关键毒力基因。通过构建相应缺失菌株和回补菌株以及表达重组蛋白,则进一步发现该操纵子编码的α溶血素Hly A能够导致BMECs中钙离子浓度上升并激活PKA,而激活的PKA则被报道能够通过促进Gli2磷酸化促进其降解。此外,结果显示Hly A也参与了TGFBRII的下调,但并不依赖于宿主细胞内的钙离子浓度变化和PKA激活。由此可以认为,致脑膜炎Ex PEC能够通过分泌α溶血素Hly A下调BMECs中的TGFBRII和Gli2,从而阻断星形胶质细胞与内皮细胞间基于TGFβ1的细胞间通讯,由此削弱屏障功能。3、阐明了激活BMECs中Hedgehog信号能够通过上调mi R-155抑制感染导致的炎症反应。进一步的结果显示,重组TGFβ1和HH信号激动剂SAG能够保护RS218感染小鼠进免于死亡。研究发现,一方面二者对HH信号的激活能够直接促进紧密连接蛋白ZO-1的表达,维持BBB结构完整和低通透性。另一方面,HH信号激活后能够上调BMECs中mi R-155表达,从而抑制其胞内由细菌感染引起的Erk1/2信号激活及进一步的黏附分子E-selectin、炎性因子IL-6和趋化因子MIP-2的表达,从而抑制感染动物脑内小胶质细胞的激活并降低脑内感染时IL-6和MIP-2的含量。而在以重组TGFβ1对小鼠进行处理时,在BMECs细胞中激活的非经典HH信号也能产生相同的效果。本研究的结果显示,星形胶质细胞来源的TGFβ1能够激活BMECs胞内非经典的HH信号而增强BBB的屏障功能。致脑膜炎Ex PEC菌株RS218则能够借助溶血素Hly A下调关键宿主蛋白TGFBRII和Gli2抑制这一细胞间通讯过程。而HH信号激动剂SAG则能够通过保护屏障完整性和抑制BMECs免疫激活对RS218感染动物产生良好的保护效果。本研究揭示了细菌病原破坏BBB完整性的新机制,鉴定到了关键毒力蛋白Hly A,增强了对Ex PEC致病过程的认识,并提示靶向HH信号筛选抗细菌感染药物的可能性。