视网膜变性疾病（Retinal degeneration，RD）是一类严重的致盲性疾病，主要包括视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa，RP）和年龄相关性黄斑病变（Age-related macular degeneration ，AMD ）等，此类疾病以视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelium，RPE）细胞和/或感光细胞病变导致的感光细胞凋亡为主要病理特征，且感光细胞无法再生。近几十年来，大量的研究致力于寻求视网膜变性疾病有效的治疗方法，目前的主要治疗策略包括基因治疗、干细胞移植治疗、人工视觉假体等，但尚无有效的治疗措施。由于视网膜变性疾病病程中感光细胞凋亡的特征，感光细胞替代治疗被认为是一项重要的潜在治疗策略。视网膜前体细胞（Retinal progenitor cells，RPCs）来源于胚胎视网膜组织，具有一定的增殖、分化能力，可以有效的分化为神经视网膜中各种细胞，且安全性较高。早期实验研究证实，RPC移植后，可与宿主视网膜整合并分化[1]。MacLaren等[2]将感光前体细胞移植至成年或变性视网膜，移植细胞可以整合并形成突触连接，改善宿主视功能。Aftab 等[3]研究发现，将 RPCs 移植至 rd1-/rhodopsin-小鼠视网膜下腔后，可与宿主视网膜整合并分化，且表达rhodopsin。多个团队发现将 Nrl-GFP+视杆前体细胞移植至 GNAT1-/-小鼠视网膜下腔，移植细胞可以分化为成熟的感光细胞，建立突触连接，且能形成光电转换，改善小鼠视功能[4，5]。本课题组Liu等[6]将人胚胎来源的RPC纯化、扩增后移植到皇家外科学院（Royal college of surgeons，RCS）大鼠视网膜下腔，发现hRPC可以在RCS大鼠视网膜下腔存活，并可以维持变性大鼠的视功能和外核层厚度至术后6周。基于这些结果，本课题组进行了Ⅰ期临床试验，并对接受hRPC移植的8例晚期视网膜色素变性患者随访观察至术后24月，证实了hRPC治疗视网膜变性的长期安全性和可行性。　　在视网膜变性疾病早期，Müller细胞可以被激活，通过增殖、释放细胞因子、清除兴奋性神经毒性、释放抗氧化剂等发挥神经保护作用，从而保护视网膜[7]。但在病变晚期，Müller细胞在视网膜表面及下腔形成大量胶质瘢痕，阻断神经视网膜和脉络膜之间的营养物质交换，从而加重视网膜损伤[8，9]。Müller细胞形成的胶质瘢痕，严重影响了移植至视网膜下腔的干细胞的存活、迁移及分化，导致移植细胞的存活率降低，移植效果减弱[10]。同时，随着变性程度的加重，视网膜色素上皮的完整性受到破坏，视网膜下腔的免疫豁免特性被破坏，从而导致较多的移植细胞发生了免疫反应[11]，进一步减弱了干细胞移植治疗视网膜变性疾病的效果。因此，变性视网膜微环境的改善是提高干细胞移植作用的一个重要方面。　　嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）是一种独特的胶质细胞，它主要存在于嗅觉系统，包括嗅黏膜、嗅神经，以及嗅球的外神经层。在成熟嗅觉系统中，OECs的主要作用是引导嗅觉神经轴突从鼻腔黏膜生长至嗅球，并在大脑形成突触[12]。因此，OECs 构成了一个连续的细胞基层或通路，从而支持初级嗅觉轴突可以从外周再生至中枢神经系统[13，14]。由于OECs独特的功能，近几十年来，OECs移植治疗中枢神经系统疾病和损伤成为研究的热点。视神经作为神经系统的一部分，其损伤修复过程与中枢神经系统类似，因此，研究者将OECs运用到视神经的损伤修复中。将OECs移植至视神经横断的大鼠的神经横断处，Li等[15]发现，OECs可以在视神经横断处存活，并能促进视神经节细胞轴突的再生。在青光眼大鼠模型中，移植的OECs可以向视神经头迁移，提示其可能在青光眼过程中有保护视盘的作用[16]。Leaver等[17]研究发现，OECs 可以在体外促进视神经节细胞的轴突再生。根据 OECs的这些作用，本课题组将OECs移植至RCS大鼠的视网膜下腔，在前期实验中我们发现，OECs能够在视网膜下腔存活，并向视网膜各细胞层迁移，同时OECs还能发挥吞噬作用，清除视网膜下腔堆积的过多的外节碎片[10，18]。OECs通过抑制NOTCH通路，从而抑制Müller细胞活化，减轻Müller细胞胶质瘢痕的形成，保护RCS大鼠视网膜的感光细胞[19]。因此提示，改善变性视网膜中微环境，提高移植干细胞长期存活，有助于增强干细胞移植的有效性。　　因此，我们假设：通过hOECs和hRPCs联合移植可以抑制胶质瘢痕改善变性视网膜微环境，同时能提高 hRPCs的的存活率，进而延长干细胞移植治疗视网膜变性的有效期延缓视网膜变性的进展。　　本研究包括两部分：　　第一部分：嗅鞘细胞对视网膜急性光损伤的保护作用和机制研究　　1.采用急性视网膜光损伤大鼠模型，将原代培养的大鼠 OECs 移植至急性视网膜光损伤大鼠视网膜下腔发现OECs可以在视网膜下腔存活，并显著减少视网膜光感受器丢失，减缓外核层变薄的趋势。同时OECs移植可以改善光损伤视网膜的功能，并能维持视功能至移植后 8 周。OECs 移植可以减轻强光持续照射引起的视网膜氧化应激反应。　　2.采用 H2O2诱导 661W 感光细胞氧化应激损伤模型为研究对象，通过 transwell建立共培养体系，将OECs置于上层，H2O2损伤的661W细胞置于下层。研究发现，OECs共培养可以提高损伤细胞的活性，保护661W细胞，减少损伤细胞的凋亡比例。OECs 保护感光细胞的机制之一：是抑制 iNOS 和 NOX4的升高，同时激活氧化清除酶SOD1和CAT的表达，提高损伤细胞抗氧化能力，减少ROS的堆积减少氧化应激，从而保护损伤的感光细胞。　　第二部分：人胚胎嗅鞘细胞联合人胚胎视网膜前体细胞治疗视网膜变性疾病的疗效及机制研究　　1.从人胚胎分离嗅鞘细胞和视网膜前体细胞进行培养，发现胚胎嗅球来源的hOECs细胞活性较好，经差速贴壁法纯化后，纯度较高；胚胎视网膜来源的视网膜前体细胞经条件培养基培养后，可以扩增，并保持较好的前体细胞标记。　　2.采用RCS慢性视网膜变性大鼠模型，将hOECs和hRPCs移植至其视网膜下腔后发现，联合移植对变性大鼠视功能的改善作用优于单移植组，可以维持视功能至移植后12周。hOECs移植对视网膜Müller细胞胶质化有抑制作用，联合移植对ONL保护作用效果最好，且持续时间最长，可以减缓ONL变薄的速度至移植后16周。通过transwell共培养体系，hOECs可以促进hRPCs向感光细胞方向分化，且出现少量成熟感光细胞标记的细胞，同时也促进 hRPCs的GFAP 水平升高，提示 hRPCs 向胶质细胞分化。移植后4周，仅联合移植组可见少量hRPCs表达感光细胞和内层神经元标记，提示 hOECs 可促进联合移植组 hRPCs 向视网膜神经元分化。联合移植提高干细胞移植有效性的机制可能是：hOECs通过抑制Müller细胞过度活化和调控小胶质细胞的活化，改善变性视网膜微环境，促进hRPCs的存活，同时，hOECs可以促进hRPCs向感光前体分化，延缓病变进程。　　根据以上结果，本研究得出以下结论：　　1.通过研究 OECs 挽救急性损伤感光细胞的作用，发现 OECs 可以通过减轻氧化应激保护损伤的视网膜感光细胞。　　2.本研究率先进行人胚胎原代培养的OECs和RPCs联合移植治疗视网膜变性疾病的研究，并证实联合移植对变性大鼠视功能的改善作用优于单移植组。　　3.研究发现，OECs 移植后可以减轻氧化应激水平、抑制 Müller 细胞的活化和胶质瘢痕形成，调控小胶质细胞的活化，从而改善变性视网膜微环境，促进 RPCs 在视网膜下腔的存活，使联合移植减缓变性视网膜外核层变薄的效果延长至术后16周，可能是联合移植延长干细胞移植有效性的机制之一。　　4.研究发现，OECs可以促进RPCs向感光前体分化，可能是联合移植延长干细胞移植有效性的机制之二。