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目的紫杉醇是食管癌一线治疗药物,但耐药性的出现影响了紫杉醇的疗效。肿瘤干细胞作为肿瘤间异质性的一部分,对传统的化疗具有固有耐药性,此外化疗耐药也能导致干细胞样特性细胞的富集,是治疗失败、肿瘤复发的主导因素,靶向抑制肿瘤干细胞特性将是治疗肿瘤耐药的有效策略。本研究旨在探讨木犀草素对食管癌耐药细胞肿瘤干性的影响并探讨其具体作用机制。方法1.采用MTT实验检测食管癌亲本细胞TE-1与EC109及其耐药细胞TE-1/PTX及EC109/PTX对紫杉醇的敏感性,检测耐药细胞的耐药程度。2.采用微球形成实验、平板克隆实验检测食管癌TE-1与TE-1/PTX,EC109与EC109/PTX细胞自我更新能力以及克隆形成能力的差异以及木犀草素对食管癌耐药细胞TE-1/PTX与EC109/PTX自我更新能力以及克隆形成能力的影响。3.采用Western blotting实验检测干性标志蛋白在亲本细胞和耐药细胞之间的表达差异以及木犀草素对干性标志蛋白表达的影响。4.采用qRT-PCR实验检测干性相关蛋白其mRNA 水平在亲本细胞和耐药细胞之间的表达差异以及木犀草素对其表达的影响,采用Western blotting实验检测影响干性蛋白表达的相关信号通路蛋白在亲本细胞和耐药细胞之间的表达差异以及木犀草素对其表达的影响。5.通过划痕实验以及Transwell实验检测TE-1与TE-1/PTX,EC109与EC109/PTX细胞迁移能力的变化以及木犀草素对食管癌耐药细胞迁移能力的影响。采用 Western Blotting 实验检测 TE-1 与 TE-1/PTX,EC109 与 EC109/PTX 细胞EMT相关蛋白的变化以及木犀草素对EMT相关蛋白表达的影响。6.采用有限稀释法建立食管癌细胞裸鼠异种移植瘤模型,评价亲本与耐药细胞体内致瘤能力的变化以及木犀草素对耐药细胞体内致瘤能力的影响。通过Western blotting实验检测裸鼠移植瘤组织中干性相关蛋白表达情况,探讨木犀草素的体内作用机制。7.通过试剂盒检测木犀草素对裸鼠肝肾功能以及血液生化指标的影响,初步评价木犀草素的动物体内毒性。结果1.食管癌耐药细胞TE-1/PTX与EC109/PTX呈现中等程度耐药。2.食管癌耐药细胞TE-1/PTX与EC109/PTX较其亲本细胞具有更强的自我更新能力以及克隆形成能力,而木犀草素可以抑制耐药细胞TE-1/PTX与EC109/PTX的自我更新能力以及克隆形成能力。3.耐药细胞TE-1/PTX与EC109/PTX与亲本细胞相比,干性标志蛋白SOX2表达增多,木犀草素可以明显抑制耐药细胞SOX2蛋白的表达。4.耐药细胞TE-1/PTX中SOX2 mRNA水平低于亲本细胞TE-1,耐药细胞中PI3K/AKT信号通路激活,E3泛素连接酶UBR5下调,木犀草素作用后PI3K/AKT信号通路受到抑制、UBR5下调。5.食管癌耐药细胞TE-1/PTX与EC109/PTX较其亲本细胞具有更强的迁移能力,而木犀草素可以抑制耐药细胞的迁移能力。耐药细胞IE-1/PTX与EC109/PTX中EMT相关蛋白,间质标志蛋白Slug、N-cadherin、Vimentin表达量升高,上皮标志蛋白E-cadherin、β-catenin表达量下调,而木犀草素作用后发现 Slug、N-cadherin、Vimentin 表达量下调,E-cadherin 表达量上调。6.在食管癌细胞裸鼠移植瘤模型上,木犀草素可有效抑制食管癌耐药细胞的体内致瘤能力;木犀草素对食管癌裸鼠移植瘤组织干性相关蛋白、PI3K/AKT信号通路相关蛋白、EMT相关蛋白的影响与体外结果基本一致。7.在食管癌耐药细胞异种移植瘤模型上,木犀草素对裸鼠体重没有明显影响,对主要脏器没有明显的毒性,对血液生化指标也无明显影响。结论1.木犀草素抑制食管癌耐药细胞TE-1/PTX与EC109/PTX的干性以及迁移能力,分别与其抑制SOX2蛋白表达和抑制EMT进程相关。2.实验结果表明耐药细胞SOX2蛋白过表达是由于p-AKT(S473)对SOX2蛋白的磷酸化作用促进其稳定性并且下调UBR5使其泛素化作用减弱,使得SOX2蛋白表达增多。木犀草素通过同时抑制PI3K/AKT信号通路与UBR5蛋白的表达从而下调SOX2蛋白。3.木犀草素可抑制耐药细胞在体内的致瘤能力,对肿瘤生长有一定的抑制作用,体内作用机制与体外机制基本一致。且在治疗剂量下,木犀草素无明显的体内毒性。