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本研究旨在探索表观遗传因子EZH2在胰腺癌恶性增殖中的作用,并阐释其分子机制,为胰腺癌的治疗提供新的思路和理论依据。在肿瘤的发生发展过程中,表观遗传因子EZH2的表达异常增高,造成细胞增殖、周期、迁移和侵袭等细胞行为失常。本研究构建了EZH2过表达、敲低和set domain缺失的正常胰腺细胞和胰腺癌细胞的稳转株,探讨了其对细胞生物学特性的影响,借助转录组测序的方法探讨其可能的作用机制,以期对胰腺癌患者新的诊断标志物及新药靶点的发掘提供重要理论及实验依据。主要研究内容如下:1.收集胰腺癌病例60例石蜡切片及患者的详细临床资料,通过免疫组化实验检测EZH2在不同患者中的表达情况,明确EZH2在胰腺癌中的表达。结果表明:EZH2主要表达于肿瘤细胞胞核,呈现淡黄色至棕黄色颗粒沉淀。而正常胰腺组织呈现蓝色,没有观察到EZH2表达。2.构建EZH2基因的过表达质粒、set domain缺失的质粒,购买EZH2基因的敲低质粒,并通过PCR方法和质粒测序技术进行验证。采用慢病毒转染的方法,将验证成功的质粒分别转染正常胰腺细胞HPDE6-C7和胰腺癌细胞BxPC-3,并利用RT-qPCR方法和Western blot技术进行验证,分别检测EZH2在mRNA和蛋白水平的表达。结果表明,我们成功构建了EZH2过表达、敲低和set domain缺失的正常胰腺细胞及胰腺癌细胞稳转株,为后续实验奠定了基础。3.通过MTS实验、集落形成实验和Ki-67抗体检测实验,明确EZH2对正常胰腺细胞和胰腺癌细胞增殖的影响。结果显示,对于胰腺癌细胞BxPC-3而言,转染EZH2过表达质粒能够使细胞增殖能力增强,与对照相比增强38%。EZH2敲低质粒导致细胞增殖能力减弱,与对照相比减弱16%-40%。EZH2基因的set domain缺失后,对胰腺癌细胞的增殖能力几乎无影响。4.利用流式细胞技术检测细胞周期,明确EZH2对正常胰腺细胞和胰腺癌细胞周期的影响。结果显示,EZH2对胰腺癌细胞Bx PC-3的周期几乎无影响。5.通过划痕实验和Transwell实验,检测EZH2对正常胰腺细胞和胰腺癌细胞迁移能力的影响。结果显示,EZH2过表达能够显著增强细胞的迁移能力,EZH2敲低则会减弱细胞的迁移能力,EZH2 set domain缺失对正常胰腺细胞和胰腺癌细胞的迁移能力几乎无影响。6.选择EZH2基因敲低质粒及其空载的胰腺癌细胞Bx PC-3稳转株进行转录组测序,根据生物信息学分析结果,选择与细胞增殖相关的4个差异表达基因(E2F1、GLI1、CDK3和Mcm4)进行RT-qPCR实验验证,实验结果与转录组测序结果一致,表明EZH2影响细胞增殖,可能与这四个基因的异常表达相关。同时,检测不同细胞株中上皮细胞-间充质转化标志物E-cadherin(即CDH1)的表达水平变化,结果表明EZH2过表达引起E-cadherin表达降低,导致组织内细胞黏附能力减弱,增加了细胞活动性。相反,EZH2敲低会引起E-cadherin蛋白表达水平上升,增强了组织内细胞黏附程度,阻碍了细胞迁移。这与EZH2影响细胞迁移的结果一致,提示EZH2可能通过调控E-cadherin而对胰腺癌的迁移产生影响。本研究初步阐释了EZH2基因参与胰腺癌恶性增殖的分子机理。