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目的:人羊膜间充质干细胞是否与人脱细胞羊膜支架成功复合。方法:1)取不同产妇胎盘获取羊膜后,运用去污剂+酶消化法制备人脱细胞羊膜支架,将已制备成功的HAAM行HE染色后于倒置相差显微镜观察HAAM与HAM的形态特征以及细胞移除情况。行免疫荧光染色后于倒置荧光显微镜下进一步观察HAAM移除细胞情况以及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)损伤情况。2)同上法获取新鲜羊膜,采用酶联消化法获得h AMSCs。h AMSCs的增殖活性及表型分子分别采用CCK-8法及流式细胞术分析鉴定进行检测。对h AMSCs成骨、成软骨及成脂分化能力予以茜素红、甲苯胺蓝及油红O染色法检测。针对h AMSCs纯度鉴定采用免疫荧光法检测第3代h AMSCs的波形蛋白与CK-19表达情况。3)将HAAM与第3代h AMSCs共培养,分别在培养14d及21d时应于倒置显微镜以及扫描电镜观察h AMSCs与HAAM复合情况;此外,将第3代h AMSCs进行细胞膜染色后予同样方法与HAAM共培养后于倒置荧光显微镜下观察;制备HAAM浸提液,将h AMSCs分为HAAM组与阴性对照组,分别予以HAAM浸提液与基础培养基培养,运用CCK-8法检测2组h AMSCs在1-7d的增殖活性。结果:1)去污剂+酶消化法所备至HAAM使用HE染色在倒置显微镜下观察可见正常HAM上皮层完整,基底膜深面有大量h AMSCs细胞核。HAAM上皮层完全脱离,h AMSCs已基本移除,基底膜无明显破坏。免疫荧光染色显示Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原在新鲜人羊膜以及人脱细胞羊膜中均呈阳性表达,DAPI染色可见人脱细胞羊膜呈阴性表达,人羊膜呈阳性表达。2)酶消化法可提取足量h AMSCs原代细胞,h AMSCs传代培养后,其形态逐渐转变为长梭形,螺旋样贴壁生长。h AMSCs能够表达MSCs表型通过流式细胞学检测鉴定结果证明。镜下可见第3代h AMSCs波形蛋白表达绿色荧光,CK-19无阳性表达。第3代h AMSCs经成骨诱导分化21d,予以茜素红染色,细胞密度增加,可见斑块状褐色物质,部分细胞变成小圆形矿化结节;成脂肪诱导21d,予以油红O染色,细胞排列散乱,细胞形状改变,类圆形细胞中出现脂滴样物质;成软骨诱导21 d,予以甲苯胺蓝染色,可见细胞部分消失,细胞核增大,偏心。3)将HAAM与第3代hAMSCs共培养,在经过7d的培养过程中,采用CCK-8 assay试剂盒检测细胞的生长、增殖情况,结果显示HAAM浸提液组与普通培养基组细胞均生长良好,在第3-7天时出现细胞增殖水平出现显著差异(P<0.05)。倒置显微镜及扫描电镜示第3代h AMSCs与HAAM共培养14d及21d,倒置荧光显微镜结果显示h AMSCs与HAAM共培养21d后均可见h AMSCs与HAAM黏附良好,广泛分布于HAAM中,h AMSCs排列整齐,呈纺锤形或长梭状。结论:1)去污剂+酶消化法备至HAAM可完全清除HAM上的细胞成分,ECM结构无明显破坏。2)h AMSCs具有向脂肪细胞,软骨细胞与成骨细胞分化的潜能,并且增殖稳定,与普通MSCs的特性类似,可作为备选种子细胞应用于不同组织工程。3)HAAM能够有效促进h AMSCs黏附,并且未发现排斥反应及毒性。HAAM可以作为负载细胞的载体为组织工程研究提供新型支架。为后期构建组织工程韧带以及促进韧带腱骨愈合奠定前期实验基础。