论文部分内容阅读
目的在脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG体内动员大鼠MSCs的基础上,研究动员后外周血中MSCs的生物学特性,探讨HIF-1及下游SDF-1/CXCR4和VEGF/VEGFR信号通路在动员中的作用及机理。方法(一)DMOG对大鼠MSCs动员作用研究:①将雄性SD大鼠随机分为两组:DMOG组(腹腔注射DMOG40mg/kg)、NS组(给予相同体积的生理盐水),连续给药7d;②CFU-F法检测大鼠外周血和骨髓中MSCs的数量;③流式细胞术检测大鼠外周血和骨髓中CD45-CD90+细胞群比例。(二)DMOG动员后外周血中MSCs生物学特性研究:①流式细胞术检测动员后外周血中MSCs(PB-MSCs)的免疫表型;②采用形态学观察、特异性鉴定来研究PB-MSCs的体外成神经、成软骨、成骨、成脂分化潜能;③cck-8法检测PB-MSCs与骨髓中MSCs(BM-MSCs)的生长曲线;④流式细胞术检测PB-MSCs与BM-MSCs的细胞周期;⑤Transwell法检测PB-MSCs与BM-MSCs的迁移能力。(三)HIF-1及下游信号通路在DMOG动员MSCs中的作用机理:①将雄性SD大鼠随机分为五组:DMOG组、YC-1组、AMD3100组、SU5416组、NS组;②分别采用CFU-F法与流式细胞术检测各组大鼠外周血和骨髓中MSCs的数量及CD45-CD90+细胞群比例;③ELISA法检测各组外周血清及骨髓上清中SDF-1α及VEGF蛋白浓度;④Western blotting法检测各组骨髓细胞中HIF-1α、SDF-1α及VEGF蛋白表达水平;⑤免疫组化检测各组骨髓微血管数量。结果(一)DMOG对大鼠MSCs动员作用研究:①同NS组比较,DMOG组外周血与骨髓 CFU-Fs 数量均显著增加(1.4±0.54 vs 2.6±0.54;9.2±0.83 vs 13.4±1.14,P<0.05);②同NS组比较,DMOG组外周血与骨髓CD45-CD90+细胞群比例均增加(2.94±0.06%vs 3.67±0.17%;6.37±0.23%vs 15.3±0.33%,p<0.05)。(二)DMOG 动员后外周血中MSCs生物学特性研究:①PB-MSCs抗原表面表达情况:PB-MSCs阴性表达造血系标记 CD34(2.16±1.60%)、CD45(0.82±0.55%),阳性表达 CD90(98.66±0.77%);②PB-MSCs具有成神经、成软骨、成骨、成脂分化的潜能;③PB-MSCs增殖能力较BM-MSCs弱,PB-MSCs与BM-MSCs的具有相似的潜伏期、对数生长期和平台期,且生长曲线呈“S”型;④细胞周期检测结果显示:PB-MSCs处于S期细胞比例低于BM-MSCs(10.15±0.64%vs 14±0.54%,,P<0.05);⑤PB-MSCs 对趋化因子 SDF-1α的迁移能力较 BM-MSCs 弱(108.6±14.61 vs 133.4±14.37/100×,P<0.05)。(三)HIF-1 及下游信号通路在DMOG动员MSCs中的作用机理:①同DMOG组比较,YC-1组、AMD3100组、SU5416组外周血与骨髓CFU-Fs数量均显著减少(2.6±0.54 vs 1.2±0.83、1.6±0.54、1.6±0.54;13.4±1.14 vs 9.8±0.83、10.4±1.14、9.6±1.14,P<0.05);②同DMOG组比较,YC-1组、AMD3100组、SU5416组外周血与骨髓CD45-CD90+细胞群比例均降低(3.67±0.17%vs 2.52±0.05%、2.55±0.10%、2.48±0.07%;15.3±0.33%vs 12.6±0.31%、13.1±0.55%、11.6±0.53%,P<0.05);③同DMOG 组比较,YC-1 组HIF-1α浓度及蛋白表达显著降低(P<0.05),AMD3100组SDF-lα浓度及蛋白表达显著降低(P<0.05),SU5416组VEGF浓度及蛋白表达显著降低(P<0.05);④同NS组比较,DMOG组骨髓微血管数量显著增加(25±2.57 vs 38.7±4.96%,P<0.05);同DMOG组比较,SU5416组骨髓微血管数量显著减少(38.7±4.96 vs 24.7±2.06%,P<0.05)。结论(1)DMOG对大鼠MSCs具有动员作用,能增加外周血与骨髓中MSCs的数量,提高外周血与骨髓中CD45-CD90+细胞群比例。(2)PB-MSCs阴性表达造血系标记CD34、CD45,阳性表达CD90,且具有成神经、成软骨、成骨、成脂分化的潜能,证实DMOG动员后所培养的外周血单个核细胞为MSCs;同时DMOG动员后外周血中MSCs与骨髓中MSCs同样具有增殖及迁移能力。(3)DMOG在动员MSCs中可上调HIF-1α的表达,且YC-1抑制HIF-1α表达后,外周血与骨髓中MSCs的数量及CD45-CD90+细胞群比例均减少,动员效率降低,提示HIF-1α在DMOG诱导MSCs动员中起关键作用。(4)DMOG在动员MSCs中可上调SDF-1α、VEGF的表达,且SDF-1/CXCR4信号通路经AMD3100阻断,VEGF/VEGFR信号通路经SU5416阻断后,外周血与骨髓中MSCs的数量及CD45-CD90+细胞群比例均减少,动员效率均降低,提示HIF-1直接调控的下游SDF-1/CXCR4及VEGF/VEGFR信号通路在DMOG诱导MSCs动员中均具有重要作用。