[研究目的]异基因造血干细胞移植(allogeneic stem cell transplatation,allo-HSCT)后部分患者出现一系或多系血细胞减少,临床上以红系、巨核系减少为主,多见于II°以上急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD),巨细胞病毒感染,更昔洛韦类抗病毒药物使用等情况。持续性血细胞减少提示患者预后不良,是移植相关并发症或死亡的重要原因之一。目前关于移植后造血功能不良的机制尚不十分清楚,治疗手段有限。本研究主要纳入接受allo-HSCT的血液系统恶性肿瘤患者,动态观察移植前后各时间点白细胞、中性粒细胞、血红蛋白、血小板计数水平、骨髓和外周血细胞因子的动态变化,分析造血功能不良特别是持续性血小板减少患者的临床特征及相关危险因素。利用骨髓体外集落培养、多参数流式细胞术分析各类造血干、祖细胞增殖情况,探究异基因造血干细胞移植术后造血功能异常、尤其是血小板减少的机制,为临床治疗提供新策略。[研究方法]移植后血小板减少患者的临床特征分析2015年8月至2017年2月接受allo-HSCT的病历资料完整且移植后无复发的血液系统恶性肿瘤患者56人,动态观察其移植前(-7天),移植后15天、30天、60天、90天、180天、270天、360天的外周血三系计数变化,根据有无aGVHD及血小板减少(Thrombocytopenia,TP)发生分为3组:1)aGVHD/TP组:移植后+30天内造血重建成功,其后发生II°以上aGVHD,而后出现持续性血小板减少(<20x10~9/L)7天以上,骨髓巨核增生低下,仍需输注血制品支持;2)造血良好组:移植后+30天内造血重建成功,血象稳定并逐渐恢复至正常水平(>90x10~9/L),未发生II°以上aGVHD;3)造血不良组:移植后无aGVHD表现,血小板重建缓慢,+90天内血小板计数持续<90x10~9/L;另选取健康供体作为对照组。骨髓体外集落培养(CFU)将上述时间点骨髓,体外分离获取单个核细胞,进行体外集落培养,包括粒细胞集落形成单位(CFU-G)、巨噬细胞集落形成单位(CFU-M)、粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、混合细胞集落形成单位(CFU-Mix)、红细胞集落形成单位(CFU-E)、爆式红细胞集落形成单位(BFU-E)、巨核细胞集落形成单位(CFU-Mk),每组6个复孔,12-14天后显微镜下计数集落。骨髓微环境的变化将上述时间点骨髓,体外分离纯化为单个核细胞,取1x10~6单个核细胞标记单克隆抗体,应用多参数流式细胞术检测造血干/祖细胞(CD34~+)、造血干细胞(CD34~+CD38~-)、造血祖细胞(CD34~+CD38~+)、髓系祖细胞(CD34~+CD38~+CD135~+CD10~-)、巨核系-红系定向祖细胞(CD34~+CD38~+CD135~-CD10~-)细胞群;骨髓内皮细胞(CD45~-CD34~+CD309~+)、管周细胞(CD45~-CD34~-CD146~+)和骨髓巨核细胞(CD41~+);CD3~+T细胞、CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD8~+T细胞、Th1(CD3~+CD4~+IFN-r~+)、Th2(CD3~+CD4~+IL-17~+)、Th17(CD3~+CD4~+IL-17~+)、Treg(CD3~+CD4~+CD25~+Fox P3~+)。统计学分析分析3组外周血三系恢复情况及与aGVHD的关系,采用IBM SPSS Statistics 20、Graphpad Prism5统计分析,利用Kaplan-Meier生存曲线分析总体生存,Log-rank对生存差异进行比较。[结果]1、移植后100天内发生临床II°以上aGVHD13例,其中aGVHD/TP组共10例。按照移植后100天内aGVHD及并发血小板减少的情况将病人分为:aGVHD/TP17.86%(10/56),造血良好组为66.07%(37/56),造血不良组为16.07%(9/56)。中位aGVHD发生时间为52(24-92)天,aGVHD/TP组较造血良好组总体生存明显减低(P<0.0001)。aGVHD/TP组移植后血小板计数较造血良好组明显减低,同时伴血红蛋白计数下降,中性粒细胞计数无明显下降。骨髓形态学检查示:aGVHD/TP组中巨核细胞数量在aGVHD发生后减少,伴巨核细胞呈小圆巨核发育异常,产板减少,aGVHD/TP组与造血不良组巨核细胞数量无显著统计学差异;aGVHD/TP患者外周血中IL-2R在aGVHD发生时明显增高,且与血小板计数呈相反变化趋势。2、与正常供者来源骨髓相比,allo-HSCT后患者集落形成能力减低,以巨核系红系祖细胞(MEP)阶段为主,+60天后缓慢恢复至与正常供体相似;aGVHD/TP组较造血不良组各系CFU频率减低,但组间差异上无明显统计学意义;aGVHD/TP组各系造血细胞CFU频率较造血良好组明显下降,在移植后+90天组间差异明显;且巨核细胞呈现分化发育异常。3、造血良好组HSC/HPC的比例是波动变化的,整体水平高于aGVHD/TP组及造血不良组,在移植后1年内造血良好组HSC/HPC比例尚未完全恢复正常;其HSC、HPC、MEP均低于正常对照组,且MEP较其他细胞群恢复慢。aGVHD/TP组骨髓造血干/祖细胞及下游祖细胞相对比例均较造血良好组减低,在移植+30天以后差异明显,主要表现在HPC、CMP及MEP细胞群。4、在移植后15天至180天,aGVHD/TP组骨髓内皮与造血良好组相比,aGVHD/TP组与正常对照组相比均无显著差异;aGVHD发生后,aGVHD/TP组管周细胞及巨核祖细胞数目较其他两组明显减低。5、aGVHD/TP组Th1细胞群较造血良好组增高,造血不良组与造血良好组变化相似。[结论]1、Allo-HSCT后患者多存在血红蛋白及血小板恢复迟缓,aGVHD/TP患者血小板计数较造血良好组明显减低,同时骨髓形态中巨核细胞比例明显下降,从各种细胞的恢复趋势看,造血不良组不同于aGVHD/TP组,造血最终能缓慢恢复。2、Allo-HSCT后患者各系集落形成能力减低,以CFU-E/BFU-E及CFU-Mk为主,aGVHD/TP组红系及巨核系集落除了数量上更明显的下降外,培养的巨核细胞呈现小圆巨核形态异常,产板减少,可能与aGVHD对造血细胞的二次打击有关。3、Allo-HSCT后流式检测骨髓造血细胞比例下降,以HSC/HPC及MEP为主,造血良好组HSC/HPC比例在移植后1年尚未完全恢复至正常,提示allo-HSCT使造血系统受损。而aGVHD/TP组各群造血细胞比例下降更为明显,提示aGVHD环境下干/祖细胞群造血抑制程度加深。4、aGVHD/TP组骨髓内皮虽无明显下降,由于病例数少,不能确定是否影响造血;aGVHD/TP组巨核祖细胞数目较其他两组明显减低,巨核细胞的异常可能对骨髓造血微环境异常有贡献。5、aGVHD/TP组Th1细胞群可能与aGVHD下血小板减少发生有关。