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第一部分：pDCs的体外培养方法的建立目的：建立浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)的体外培养方法。方法：采集健康产妇脐带血40mL,分离脐带血单个核细胞,用含重组人FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3-Ligand, Flt3-L)100ng/ml、白细胞介素(interleukin, IL)-310ng/mL的RPMI1640完全培养基连续培养7d,每隔1天半量换液。第8天加入2μg/mL的CpG ODN,24h后收集细胞行流式检测,同时检测pDC培养上清IFN-α水平检测。在培养过程中,用倒置相差显微镜观察培养孔中的pDCs形态特征变化。结果：脐带血单个核细胞培养2.h后可见圆形扁平细胞布满视野,24h后细胞开始贴壁,细胞质伸展开,看起来体积有所增大,圆形,透亮,并可见散在的小集落形成。培养第3-4天,细胞体积较前继续增大,多数为圆形,部分细胞表面可见小的突起,并可见少量梭形、蝌蚪状、星形或其他不规则形的细胞,培养液中集落较前明显增多、增大。培养第5-8天,集落数量及集落内细胞数逐渐减少,而培养液中圆形或具有小突起的悬浮细胞逐渐增多。流式细胞仪检测发现CD123、BDCA-2、 BDCA-4均表达阳性的细胞,该细胞为pDCs。在培养过程中,pDCs比例不断增加,其中pDCs在培养开始时仅占脐带血单个核细胞总数的1.08%,第4天升至5.32%,第8天时达到高峰,为19.8%。培养第8天,pDC培养上清进行IFN-α水平达11302±1745.31pg/mL。第二部分：HBV对健康产妇脐带血pDCs TLR9、IRF-7、IFN-α的表达影响目的：观察HBV对体外培养的健康产妇脐带血pDCs TLR、IRF-7、 IFN-α的表达影响。方法：体外培养HepG2.2.15细胞,培养第12天收集各孔HepG2.2.15培养上清,超离心HBV病毒颗粒,留120μL病毒溶液,PCR荧光探针法检测HBV-DNA浓度。将培养第7天的pDCs与不同载量的HBV(1x105copies/mL、1x106copies/mL、1×107copies/mL和空白对照)共培养24h。共培养24h后,每组均加入终浓度为2μg/mL的CpG ODN2216继续培养24h。Real-Time PCR检测pDCs中TLR9. lRF7-mRNA的表达,Western blot检测TLR9、IRF7蛋白表达,ELISA法测培养上清IFN-α水平。结果：PCR荧光探针法检测获得的HBV DNA浓度为1.8x109copies/mL,满足实验要求。HBV对pDCs TLR9mRNA、IRF7mRNA的表达呈浓度依赖性,HBV-DNA载量越高,对TLR9mRNA、IRF7mRNA表达的抑制效果越强。当HBV-DNA终浓度为1x107copies/ml时,TLR9mRNA、IRF7mRNA表达水平最低。HBV对pDCs TLR、IRF7蛋白的表达亦呈浓度依赖性,HBV-DNA载量越高,对TLR9.IRF7蛋白表达的抑制效果越强。当HBV-DNA终浓度为1x107copies/ml时,TLR9、IRF7蛋白表达水平最低。HBV对pDCs培养上清液IFN-α的表达影响亦呈浓度依赖性,HBV-DNA载量越高,对pDCs培养上清液IFN-α的表达的抑制效果越强。当HBV-DNA终浓度为l×107copies/ml时,pDCs培养上清液IFN-α的表达水平最低。第三部分HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs TLR9. IRF7. IFN-α变化及补肾解毒法对其表达的影响目的：比较HBV感染免疫耐受期产妇脐带血及健康产妇脐带血pDCs TLR9、IRF7、IFN-a变化及补肾解毒法对免疫耐受期产妇脐带血PDCsTLR9、IRF7、IFN-a表达的影响。方法：选择湖南中医药大学第一附属医院HBV感染免疫耐受期产妇10例及健康对照10例,体外培养脐带血pDCs。同时制备补肾方(六味地黄丸)、解毒方(甘露消毒丹)、补肾解毒方(六味地黄丸合甘露消毒丹)含药血浆。将培养的第7天的pDCs分为空白组、补肾药物血浆组、解毒药物血浆组、补肾解毒药物血浆组、空白血浆组5组进行干预,培养48h后Real-Time PCR检测pDCs TLR9.1RF7-mRNA的表达,Western blot技术检测pDCs TLR9、IRF7蛋白表达,ELISA法检测pDCs培养上清IFN-α水平。结果：HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs TLR9、IRF7mRNA的表达较正常产妇明显下降。产妇外周血HBV-DNA水平与pDCs TLR9、 IRF7mRNA表达的水平呈负相关。补肾与补肾解毒含药血浆均能一定程度上提高HBV感染免疫耐受期pDC3TLR9.IRF7mRNA的表达,尤以补肾解毒组对TLR9.IRF7mRNA的表达影响最大,而解毒药物血浆不能提高HBV感染免疫耐受期pDCs TLR9.IRF7mRNA的表达。HBV感染免疫耐受期产妇pDCs TLR9.IRF7蛋白的表达较正常产妇明显下降,且产妇外周血HBV.DNA水平与pDCs TLR9.IRF7蛋白表达的水平呈负相关。补肾与补肾解毒组药物血浆均能一定程度上提高HBV感染免疫耐受期pDCs TLR9.IRF7蛋白的表达,尤以补肾解毒组对TLR9.IRF7蛋白的表达影响最大。解毒组药物血浆虽能在一定程度上提高HBV感染免疫耐受期pDCs TLR9.IRF7蛋白的表达,但与空白血浆相比,差异无显著性。HBV感染免疫耐受期产妇pDCs培养上清IFN.α的表达较正常产妇明显下降,产妇外周血HBV-DNA水平与pDCs培养上清IFN-α水平行呈负相关。补肾与补肾解毒药物血浆均能一定程度上提高HBV感染免疫耐受期pDCs培养上清IFN-α的表达,尤以补肾解毒组对pDCs培养上清IFN-α表达的影响最大,而解毒组药物血浆不能提高pDCs培养上清IFN-α表达水平。结论：1.以人CBMC为培养初始细胞,利用rh F1t3-L+IL一3联合体外诱导,可成功体外诱导出pDCs.2.HBV体外干预后,正常pDCs TLR9.IRF7mRNA及蛋白表达下降,从而导致其下游IFN-a的分泌减少。3.HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs TLR9.IRF7的表达水平及分泌INF-β的能力较正常产妇明显下降。HBV感染免疫耐受期患者体内pDCs TLR9.IRF7.INF-α仪表达减少,pDCs功能受损,是HBV逃逸机体的免疫应答,导致慢性感染的重要原因之一。4.补肾解毒法能更好地促进HBV感染免疫耐受期产妇脐带血pDCs TLR9.IRF7的表达及分泌INF-α的能力的恢复,补肾解毒法为调节机体免疫、治疗慢性乙型肝炎的基本治法。