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凡具有芳香环的氨基酸都属于芳香族氨基酸,例如酪氨酸、苯丙氨酸等。L-酪氨酸作为一种重要的生化试剂,是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料;医药上用作治疗甲状腺功能亢进的药物,也作饮料添加剂和配制人工昆虫饲料。D-苯丙氨酸是一种重要手性化合物,作为多种药物的中间体,参与合成短杆菌肽等环肽类抗生素。本研究的重点是生物酶法合成两种芳香族氨基酸L-酪氨酸和D-苯丙氨酸。1.采用双酶偶联体系制备L-酪氨酸,利用天冬氨酸转氨酶全细胞催化L-天冬氨酸转氨至苯丙酮酸,生成L-苯丙氨酸,同时得到中间产物丙酮酸;反应体系中的酪氨酸酚裂解酶全细胞催化丙酮酸、苯酚和氨酶法合成L-酪氨酸。经考察确定了双酶偶联反应的最佳条件为:温度40℃,pH 8.5,底物苯丙酮酸质量浓度为25 g/L,苯丙酮酸与L-天冬氨酸摩尔比1:1.2,天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶细胞质量比1:1,4mmol/LPLP,0.1 g/L吐温80。30g/L的氯化铵对双酶偶联反应有促进作用,转化12 h L-酪氨酸最大产量达12 g/L。双菌双酶偶联生物法合成L-酪氨酸,充分利用了反应中间产物丙酮酸得到附加值较高的L-酪氨酸,对资源合理利用及绿色合成工艺具有参考意义。2.将天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶在大肠杆菌中共表达,构建共表达基因工程菌[pETDuet-TPL-AspAT/BL21(DE3)],实现一菌双酶酶法制备L-酪氨酸。反应体系中只投入一种酶细胞,简化了实验操作,经考察此工程菌反应最佳条件同双酶偶联反应,转化12 h得到L-酪氨酸最大产量为6.7 g/L,L-酪氨酸产率降低。3.本文将乳酸氧化酶与酪氨酸酚裂解酶共表达,构建共表达基因工程菌[pETDuet-LOD-TPL/BL21(DE3)],经考察反应最佳条件为温度 45℃,pH 9.0,L-乳酸质量浓度为10 g/L,底物苯酚与L-乳酸摩尔比1.2:1;为减轻底物抑制,苯酚在反应8 h后加入,且4 h/次方式流加苯酚,使底物及产物都能达到最大效果,最终L-酪氨酸产量为5.2 g/L。本方法拓展了丙酮酸来源,为酶法合成L-Tyr工业化进行了有益探索。4.本文采用氨基酸消旋酶与苯丙氨酸解氨酶级联催化制备D-苯丙氨酸。将来源于粘红酵母的苯丙氨酸解氨酶密码子优化后进行全基因合成,与载体pETDuet-1重组,成功构建基因工程菌[pETDuet-1-PAL/BL21(DE3)]。酶学性质研究确定最佳转化条件:温度45℃,pH 9.0。表面活性剂对酶活有一定影响,质量分数0.2%的Tween-80增效最好。另外,金属离子也会不同程度地影响酶活,其中Mg2+、Ca2+对苯丙氨酸解氨酶酶活有促进作用。质量浓度为40g/L底物L-苯丙氨酸,在氨基酸消旋酶作用下转化为DL-苯丙氨酸,再经苯丙氨酸解氨酶作用,得到D-苯丙氨酸和副产物肉桂酸,L-苯丙氨酸转化率达86%。