【摘 要】
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目的:基于介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silicon nanoparticles,MSNs)构建装载miR-26a的载体系统,对该载体系统进行表征并研究其对大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)成骨分化的影响。方法:使用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)将miR-26a封装在MSN的介孔
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目的:基于介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silicon nanoparticles,MSNs)构建装载miR-26a的载体系统,对该载体系统进行表征并研究其对大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)成骨分化的影响。方法:使用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)将miR-26a封装在MSN的介孔结构内,并在其表面修饰KALA多肽,构建MSN_miR-26a@PEI-KALA载体系统。使用透射电子显微镜、纳米粒度电位仪对纳米载体的形貌结构、尺寸及表面电位进行检测。通过琼脂糖凝胶电泳检测载体对miR-26a的体外保护作用。采用CCK-8(Cell counting kit-8)法检测与载体共孵育12及24小时后rBMSCs的存活率情况;并使用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测与载体共孵育6、12及24小时后rBMSCs的miR-26a水平,以确定转染处理时间与浓度。通过流式实验检测rBMSCs与载体共孵育12小时的转染效率。通过激光共聚焦观察rBMSCs内载体的摄取与分布。rBMSCs与MSN@PEI-KALA、MSN_miR-26a@PEI-KALA、MSN_miR-NC@PEI-KALA 共孵育,未经处理的rBMSCs设置为对照组。以碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色及活性定量检测成骨诱导第3天和第5天各组细胞的成骨分化水平;以茜素红染色及钙结节半定量检测成骨诱导第14天各组细胞的细胞外基质矿化水平;以RT-PCR检测成骨诱导分化7天和14天后相关成骨基因Runx2、Opn、Osx及Bmp2的相对表达量;以免疫印记试验检测成骨诱导分化7天和14天后相关成骨蛋白OPN、OSX及BMP2的表达情况。结果:透射电镜及纳米粒度电位仪结果显示,构建的纳米载体颗粒分散性较好、表面电位呈正电。琼脂糖凝胶电泳结果显示,构建的载体能有效保护miR-26a体外不被降解。CCK-8及RT-PCR结果显示合适的转染处理时间与浓度分别为20μg/mL和12小时,此时的转染效率约为20%～30%。激光共聚焦显微镜结果显示,载体通过内吞作用进入细胞溶酶体,并通过KALA多肽膜融合和PEI的质子海绵泵机制实现溶酶体逃逸,释放miR-26a到细胞质中。成骨诱导第3天和第5天的ALP染色和定量检测结果显示,MSN_miR-26a@PEI-KALA组rBMSCs的ALP活性最高;成骨诱导第14天的茜素红染色和钙结节半定量结果显示,MSN_miR-26a@PEI-KALA组rBMSCs细胞外基质矿化水平最高。成骨诱导7天和14天后,RT-PCR结果显示,MSN_miR-26a@PEI-KALA组相关成骨基因的相对表达量高于对照组(P<0.05);免疫印记试验结果显示,MSN_miR-26a@PEI-KALA组相关成骨蛋白的表达高于对照组(P<0.05)。结论:本研究构建的载体MSN_miR-26a@PEI-KALA能有效保护、运送并释放miR-26a进入细胞质内,在体外促进rBMSCs的成骨分化,为骨组织工程中microRNA的递送提供了新的方法与策略。
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