先天性心脏病(CHD,先心病)是首位高发出生缺陷,严重危害婴幼儿健康,其病因复杂,其中环境化学物是一种重要的致病因素。抗菌剂三氯生(TCS)作为一种高效光谱抗菌剂,广泛应用于个人护理品中,具有亲脂性、持久性和累积性,可以直接透过胎盘屏障,影响胚胎系统的正常发育。我们前期研究发现TCS会影响小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化,影响斑马鱼心脏发育,出现心包水肿,幼鱼心率过缓。以上结果都说明TCS可对心脏发育产生不良影响,但作用机制不明。本项目拟采用人胚胎干细胞(h ESC)定向分化的心肌细胞为模型,从心肌细胞形态学、分化程度、心肌关键基因和蛋白表达上论证TCS的心肌毒性。从DNA甲基化方面,揭示TCS的关键调控靶点和作用方式,阐述其影响干细胞向心肌细胞分化过程的表观遗传机制,发现化学物暴露致CHD的候选生物学标志。本项目还有利于将干细胞定向心肌细胞分化模型应用于评价环境化学物的心肌发育毒性,为CHD的防治提供依据,为提高人口质量、促进儿童健康做出贡献。目的研究TCS对hESC向心肌细胞分化过程的影响,并从DNA甲基化方面,综合阐述TCS影响心肌细胞分化过程的表观遗传机制。方法1.以人胚胎干细胞H9体外定向分化心肌细胞为基础,分化开始时向细胞中添加含1μMTCS的培养液(处理组)以及0.1%二甲基亚砜的培养(DMSO,对照组),对诱导形成的心肌细胞进行检测。2.诱导开始后,于第12天,在光学显微镜下观察自发性搏动细胞团,并对跳动的心肌细胞团进行显微摄像,记录搏动频率;对自发性搏动细胞团进行心肌细胞特异因子TNNT2的免疫荧光染色,观察心肌显微结构3.染毒结束后,机械切割获得搏动和未搏动细胞团,分别标记为对照组和TCS处理组。提取心肌细胞总RNA,通过实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测心肌细胞特异性基因,DNA甲基化相关酶,以及DNA去甲基化相关基因的m RNA表达水平,再进行RNA-seq测序;此外,利用Western Blot技术对对照组和TCS实验组心肌细胞差异基因相关蛋白(NKX2.5和TET2)表达水平进行检测。4.提取对照组和TCS实验组心肌干细胞的DNA,根据RNA-seq测序结果筛选出差异表达基因,根据DNA甲基化芯片筛选出甲基化模式异常的Cp G位点,结合两者的结果获得甲基化模式异常的基因,运用亚硫酸氢盐修饰后测序法检测异常表达的基因DNA甲基化模式。结果1.胚胎干细胞成功诱导分化为心肌细胞诱导培养过程中,每天在显微镜下观察培养板中细胞形态的变化,可以见到细胞逐渐汇聚的过程,诱导分化的第12天,可见心肌细胞团出现自主搏动,并表现为节律性的收缩,表明干细胞成功分化为心肌细胞。2.TCS暴露抑制人胚胎干细胞向心肌细胞定向分化随着时间延长,于诱导day12天的时候观察到TCS处理组分化形成的心肌细胞团每分钟自主搏动速率显著减少;心肌细胞特异性因子TNNT2免疫荧光染色发现TCS处理组H9向心肌细胞分化率降低,分化形成的心肌形态未见明显改变。3.TCS暴露影响心肌分化阶段心肌细胞特异基因、DNA甲基化相关基因的表达水平和蛋白表达水平在已分化的心肌细胞中,q RT-PCR结果显示TCS处理组的心肌细胞特异性基因表达水平低于DMSO对照组;甲基化相关基因的m RNA表达在TCS组较DMSO对照组高,TCS处理组的去甲基化基因TET家族(TET1、TET2、TET3)的m RNA表达TCS组较对照组低提示;Western检测结果显示TCS染毒组的Nkx2.5表达水平显著低于对照组,TET2表达水平TCS组显著高于对照组。以上结果均提示TCS可能通过抑制心肌细胞特异性基因和蛋白表达进而发挥阻滞心肌分化的作用,并且DNA甲基化作用和去甲基化作用在TCS抑制心肌分化的过程中发挥了作用。4.TCS暴露影响H9向心肌细胞分化过程的表达结合RNA-seq测序和DNA甲基化芯片结果筛选出处理组TNNT2,GATA4的m RNA低表达,而DNA甲基化模式高表达,且两者呈显著负相关。运用亚硫酸氢盐修饰方法(BSP)验证结果显示,TCS组的GATA4和TNNT2的启动子区甲基化水平较对照组高,提示甲基化作用在TCS抑制心肌分化的过程中发挥了作用。结论TCS可通过抑制心肌细胞特异性基因和蛋白表达,从而抑制人胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化,造成心肌细胞分化率及其自主搏动频率降低,从而影响其分化效能。同时,心肌细胞特异基因启动子区甲基化水平升高,提示DNA甲基化在TCS抑制心肌细胞定向分化过程中可能发挥了调控作用。该方法为运用干细胞模型来评价环境化学物的心肌发育毒性提供了基础,为CHD的防治提供依据,为提高人口质量、促进儿童健康做出贡献。