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背景酒依赖是一种慢性复杂的疾病,受遗传、表观遗传学和环境因素影响。酒依赖导致大脑中持久的细胞变化,而这些变化部分可能是由于基因表达的持续变化引起的。miRNA是基因表达的转录后调节因子,是mRNA表达的负性调节剂,并且与成瘾相关的行为有关。研究发现,大鼠过度摄取酒精后诱导miRNA表达异常,通过调节多种神经递质相关蛋白及营养因子等进而调节酒依赖的形成,并在临床或行为表征（渴求、戒断、复饮、认知损害等）演变中起重要的调节作用。而纹状体是成瘾的关键大脑部位,大量的研究说明伏隔核为酒依赖渴求形成的关键部位。但酒依赖形成及临床表征演变中纹状体miRNA和靶基因的改变情况仍待进一步研究发现。目的构建酒依赖大鼠模型,筛选出酒依赖模型大鼠纹状体中差异表达的miRNA和mRNA,并验证miRNA对mRNA的调控作用。找出靶基因作用位点,进一步探究纹状体miRNA在酒依赖过程中的功能。方法1.前期研究基础已构建酒依赖CPP大鼠模型,提取酒依赖组大鼠（n=6）和对照组大鼠（n=6）纹状体脑区总RNA,并采用高通量测序法进行miRNA和mRNA测序,筛选出差异表达基因,通过生物信息学手段分析二者的关联性,构建miRNA-mRNA负调控网络。2.利用NCBI、GCBI等数据库,筛选酒依赖大鼠纹状体脑区中差异表达的mRNA,结合构建的miRNA-mRNA负调控网络,并利用miRWalk等软件预测miRNA,筛选miRNA-mRNA。3.再次构建CPP模型,取纹状体组织备用,用于后续验证实验。4.在组织水平,利用实时荧光定量PCR技术验证筛选的mRNA和miRNA表达情况。5.miRNA mimic/inhibitor干预PC12细胞,通过实时荧光定量PCR技术从细胞水平验证miRNA对mRNA的靶向调控作用。6.利用双荧光素酶报告基因实验检测rno-miR-26b-5p对Scn5a、rno-miR-455-3p对Scn5a,rno-miR-181b-5p对Cxcl10、rno-miR-298-5p对Cxcl10,rno-miR-29c-3p对Pcdh11x、rno-miR-582-3p对Pcdh11x的3’端非翻译区结合情况,验证rno-miR-26b-5p对Scn5a、rno-miR-455-3p对Scn5a,rno-miR-181b-5p对Cxcl10、rno-miR-298-5p对Cxcl10,rno-miR-29c-3p对Pcdh11x、rno-miR-582-3p对Pcdh11x的靶向调控作用。结果1.酒依赖大鼠纹状体脑区高通量测序结果:与对照组相比,酒依赖组样品显著性差异miRNA总数10个,其中显著上调有4个,显著下调的6个。mRNA显著性差异基因总数9个,其中显著上调基因4个,显著下调基因5个。并进一步对mRNA和miRNA的测序结果进行分析,构建miRNA-mRNA负调控网络（P均<0.05）。2.筛选出与酒精依赖、物质成瘾、神经元的保护、神经炎症、神经元的生长发育和凋亡、突触的发育与重塑等可能相关基因,如Scn5a、Pcdh11x、Cxcl10和rno-miR-29c-3p、rno-miR-582-3p、rno-miR-298-5p、rno-miR-26b-5p、rno-miR-455-3p、rno-miR-181b-5p,并在酒依赖大鼠纹状体组织中,验证基因表达水平,实时荧光定量PCR实验结果与测序结果基本一致（P均<0.05）3.利用miRNA mimic/inhibitor干预细胞,模拟miRNA在酒依赖大鼠纹状体脑区中的表达水平,上调/下调miRNA,实时荧光定量PCR结果显示:Scn5a与rno-miR-26b-5p,Scn5a与rno-miR-455-3p;Cxcl10与rno-miR-181b-5p,Cxcl10与rno-miR-298-5p;Pcdh11x与rno-miR-29c-3p,Pcdh11x与rno-miR-582-3p为酒依赖大鼠纹状体中差异表达的miRNA-mRNA负调控对。初步证实上述6组miRNA-mRNA的靶向调控作用（P均<0.05）。4.转染了rno-miR-29c-3p mimic后,野生型载体r-Pcdh11x-WT组的报告荧光出现了显著的下调。然而对预测的rno-miR-29c-3p靶位点进行突变后,突变型载体r-Pcdh11x-MUT中的报告荧光下调幅度明显降低。转染了rno-miR-181b-5p inhibitor后,野生型载体r-Cxcl10-WT组的报告荧光出现了明显的上调,然而对其预测靶位点进行突变后,突变型载体r-Cxcl10-MUT中的报告荧光下降。转染了rno-miR-298-5p inhibitor后,野生型载体r-Cxcl10-WT组的报告荧光出现了明显的上调,然而对其预测靶位点进行突变后,突变型载体r-Cxcl10-MUT中的报告荧光下降。转染了rno-miR-455-3p inhibitor后,野生型载体r-Scn5a-WT组的报告荧光出现了明显的上调,然而对其预测靶位点进行突变后,突变型载体r-Scn5a-MUT中的报告荧光出现了一定的下降。结论1.在酒依赖CPP模型大鼠纹状体脑区,Cxcl10、Scn5a基因表达水平上调,而Pcdh11x基因表达水平下降;rno-miR-29c-3p、rno-miR-582-3p表达水平上调,rno-miR-26b-5p、rno-miR-455-3p、rno-miR-181b-5p、rno-miR-298-5p表达水平下降。2.初步验证了rno-miR-26b-5p对Scn5a、rno-miR-455-3p对Scn5a,rno-miR-181b-5p对Cxcl10、rno-miR-298-5p对Cxcl10,rno-miR-29c-3p对Pcdh11x、rno-miR-582-3p对Pcdh11x靶向调控关系。3.进一步预测并验证了rno-miR-29c-3p对Pcdh11x、rno-miR-181b-5p对Cxcl10、rno-miR-298-5p对Cxcl10和rno-miR-455-3p对Scn5a的3’非翻译区调控位点。