目的：老化或衰老(Senescence)是细胞和机体成熟后的一种进行性的退化过程；随年龄的增长和／或外源性不良因素(UV辐射、光解、化学物质等)刺激的加剧,机体逐渐表现出形态和功能特征的一系列变化,同时出现相应的代偿反应。中医对机体衰老机理的研究源远流长,从《黄帝内经》到近代都有阐述和发挥,历年来诸多中医学家均认为实证血瘀与衰老的关系密切,如华佗认为“血脉流通,病不得生”；颜德馨等提出“人体衰老的本质在于气血失调、气虚血瘀”,认为“瘀是原因,虚是归宿；瘀是本质,虚是现象”。此外,韩明向更是明确提出了“血瘀致衰”的理论,认为瘀血阻滞于筋脉,使脑髓、脏腑、肌表失于濡养是机体老化的关键,而机体老化常见的呆证、癫狂、面色晦暗、肌肤出现淤斑、舌下脉络粗长、巩膜混浊、脉涩结代等皆为血瘀征象。基于以上衰老理论,近年来活血化瘀药抗衰老研究已取得较大进展,大量资料证实活血化瘀药及其活性成分对人体衰老过程中生理、病理、生化、免疫等多方面有调节和改善作用,因此活血化瘀药及其活性成分有望成为重要的抗衰老药。中药红花Flos Carthami为菊科1年生草本植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥管状花,主产于新疆,为我国经典活血化瘀药,数千年的临床验证证实了其良好的活血化瘀疗效,目前常用于闭塞性脑血管疾病、冠心病、心肌梗塞等心脑血管疾病的治疗。红花中主要含色素、酚酸类、黄酮和脂肪油等成分,其中红花黄色素(Safflower yellow, SY)为红花主要水溶性活血化瘀活性部位。SY为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物,其中含量最高、活性最强的单体成分为羟基红花黄色素A (Hydroxy safflower yellow A, HSYA),该活性单体也是我国国药准字产品—红花黄色素氯化钠注射液(批准文号：Z20050582)的主要效应成分。现代药理研究已证实HSYA在心脑血管系统、血液系统、神经系统、抗氧化、抗炎等方面具有广泛药理作用,而临床上主要用于治疗心脑血管疾病,未见有用于机体老化性疾病的报道；由此可见,具有强活血化瘀效应的单体成分HSYA在抗机体老化领域中的应用具有极大的研究价值和开发潜力。因此,本论文选择HSYA作为处理因素,针对机体老化性疾病研究领域的世界性研究热点—阿尔茨海默病、皮肤老化疾病进行药理活性研究,探讨HSYA在此类典型机体老化性疾病中发挥的保护作用,并阐明其可能的作用机制,以期为HSYA和／或红花相关中成药及制剂的临床应用开辟新的领域。方法：1.HSYA体外抗阿尔茨海默病活性研究本研究以PC12细胞为研究载体,用神经生长因子(NGF)诱导体外神经元样细胞,建立p-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein, Aβ)引起的神经细胞损伤模型,模拟与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)大脑神经元病变类似的细胞模型；以HSYA为研究对象,使用形态学观察、MTT法、LDH法、Hoechst染色等方法,探讨药物的体外最佳保护浓度,评价其对损伤神经细胞的保护作用。为了深入研究HSYA对抗Aβ诱导的神经损伤的作用机理,本研究又进一步检测了该细胞内活性氧(ROS)水平以及细胞自身的氧化还原状态、线粒体膜电位、DNA碎片水平,同时分别应用RT-PCR和Westemblot方法考察了细胞PUMA及凋亡相关基因Bcl-2的]mRNA或蛋白水平的表达变化。2.HSYA抗皮肤光老化活性研究皮肤的老化包括内源性老化和外源性老化。内源性老化又称固有老化或时间老化,为不可逆过程,仅受时间和遗传信息的支配；外源性老化是指皮肤因受到环境因素的影响而产生的退变现象,在诸多环境因素中又以紫外线(Ultraviolet,UV)的影响为首,因而又被普遍称为光老化,是一种可以预防和／或治疗的皮肤老化性疾病。因此,研究领域的抗皮肤老化研究一般是指抗皮肤外源性老化(光老化)的研究。本研究以长波紫外线(UVA)联合中波紫外线(UVB)为光源,以KM小鼠为实验动物进行皮肤外源性光老化模型的制备。在此模型基础上,皮肤涂布给予HSYA对光老化皮肤进行治疗,通过小鼠背部皮肤的宏观评分、拉伸测试及重量法等方法评价皮肤含水量、弹性及松弛(皱纹)程度,探讨HSYA对紫外线诱导的光老化模型小鼠皮肤的保护作用。为了进一步研究HSYA对抗皮肤光老化的作用机理,我们进一步通过生化定量法分析小鼠皮肤组织中系列抗氧化物酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活性,丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)等成分的含量,以及几种代表性基质金属蛋白酶(MMPs)的活性；此外,本研究还通过H&E染色、Gomori’s醛品红染色等实验方法,观察并分析动物皮肤表皮不规则增生的程度、胶原纤维和弹性纤维的形态、含量及分布,对其皮肤组织学的变化进行总体评价。结果：1.HSYA体外抗阿尔茨海默病活性研究体外药效评价结果显示,HSYA在20-80μM时,可剂量依赖性地对抗Ap引发的神经元样细胞损伤,维持细胞及突触的正常形态,显著提高细胞存活率,并明显降低LDH释放率,表现出显著地神经保护作用。体外作用机制研究结果表明,HSYA可显著提高Aβ损伤细胞内的GSH含量、线粒体膜电位以及Bcl-2/Bax的比值,降低细胞内MDA含量、促凋亡蛋白PUMA mRNA的表达、ROS的水平并减少DNA碎片的形成,抑制细胞凋亡。提示HSYA对Ap所致神经细胞损伤的保护作用机制,可能是通过降低ROS水平、维持线粒体膜电位水平,保持线粒体结构和功能的稳定性,抑制线粒体凋亡因子的释放,而起到保护作用；即HSYA通过影响线粒体凋亡途径,对Ap损伤的神经细胞起到重要的保护作用。2.HSYA抗皮肤光老化活性研究药效评价结果表明HSYA(100-200μg/mouse)可显著改善UV导致的皮肤干燥、松弛、粗深皱纹、结节、色素斑增多、皮革样外观等不良状态；并可明显缩短皮肤拉伸后恢复时间,提示HSYA可显著增加皮肤水和能力、保持其弹性、维持皮肤宏观正常表征。作用机制研究结果显示HSYA(100-200μg/mouse)可显著提高光老化小鼠皮肤组织中SOD.GSH-Px和CAT活性,大幅度提高Hyp的含量,显著降低MDA含量,抑制MMP-1及MMP-3的异常高表达；同时,组织病理学结果显示HSYA可明显改善UV导致的皮肤结构退形性变(尤其是胶原纤维、弹性纤维的扭曲断裂)维持胶原纤维、弹性纤维的正常分布。提示外涂HSYA可通过抗氧化作用而间接和/或直接影响基质金属蛋白酶的活性,抑制胶原降解,进而对抗反复UV辐射引发的皮肤光老化损伤。结论：本研究利用经典体外阿尔茨海默病细胞模型,率先发现HSYA具有良好的抑制Ap诱导的神经细胞毒性作用；同时,根据进一步的机制探索发现,HSYA主要通过影响线粒体凋亡途径而对Ap损伤的神经细胞起到重要的保护作用；提示HSYA在预防和／或治疗AD方面,具有潜在疗效的可能性。此外,本研究通过体内抗皮肤光老化(外源性老化)试验,发现HSYA可显著增加动物皮肤弹性、维持皮肤宏观正常表征；根据进一步的机制探索发现,皮肤涂布HSYA可通过抗氧化作用间接和／或直接调节基质金属蛋白酶活性,进而抑制胶原降解,而发挥抗皮肤光老化作用；提示HSYA具有潜在的防治皮肤光老化的功效。本研究有利于日后红花活血化瘀主要效应成分一HSYA在抗机体老化性疾病方面的开发应用,并为活血化瘀活性成分防治机体老化性疾病研究提供一定参考。