多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种累及中枢神经系统(central nervous system,CNS)的自身免疫性疾病,临床表现以多病灶症状体征及病程反复为特点,是导致中青年人永久性神经功能障碍的常见原因,给患者及其家庭和社会带来沉重负担。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)可以从发病表现及病理改变等多方面模拟MS,被广泛用于MS发病机制及治疗的研究。尽管目前研究认为其涉及自身免疫失衡,炎症,细胞凋亡和氧化应激等多发面,MS中神经变性的确切机制仍有待阐明。尽管目前疾病修饰药物治疗可在一定程度上减缓疾病的进展和改善患者主观不适,但神经功能缺陷往往伴随患者整个病程甚至终生。因此,加强对多发性硬化新的发病机制及治疗方法的探索成为重要课题。神经系统正常功能依赖于免疫功能的稳定,免疫稳态破坏与多发性硬化等多种神经系统自身免疫性疾病相关,免疫调节治疗也是多发性硬化治疗的重要方法。神经系统免疫功能的调节有多种分子或反应途径参与,基于我们近期研究及文献查询结果,我们提出一条新的免疫调节通路概念:可溶性 CD83(soluble CD83,sCD83)-吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)-色氨酸犬尿氨酸途径,sCD83是免疫调节相关分子,吲哚胺2,3-双加氧酶及色氨酸犬尿氨酸途径产物参与神经免疫调节作用,CD83+T细胞具有免疫调节功能。该通路各环节对MS治疗均具有重要意义。基于上述免疫调节通路,本研究中,我们分别应用吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂(曲尼司特)、拮抗剂(NLG919)以及抗氧化剂(硫辛酸)为干预剂,诱导建立实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,并给予干预,从髓鞘轴突病理变化、色氨酸犬尿氨酸代谢改变、炎性因子谱改变、细胞凋亡及氧化应激损伤、免疫调节细胞变化等多方面进行研究,探讨多发性硬化发病机制及干预剂对治疗的提示意义。第一部分 吲哚胺-2,3-双加氧酶拮抗剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究目的:以C57BL/6雌性小鼠建立多发性硬化的小鼠模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,利用吲哚胺-2,3-双加氧酶拮抗剂NLG919进行干预,观察实验小鼠发病情况,药物的干预作用,应用HE染色、电镜、Western Blot、ELISA、流式细胞术等方法,从炎性病理改变、凋亡、氧化应激、免疫调节等多方面研究探讨NLG919对EAE小鼠的影响。方法:1.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立。应用周龄为8-10周的C57BL/6雌性小鼠,体重约为18-20g,使用MOG35-55作为免疫抗原,在其中加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)并与一定含量的结核菌素充分混匀,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部多点皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX),即建立完成EAE小鼠模型。2.实验动物的分组及干预。将实验小鼠随机分为正常对照组、EAE组溶媒组及NLG919干预组。将NLG919用1.5%羧甲基纤维素钠制备悬浊液,每天现配现用,自发病第1天开始连续7天,按50mg/kg体重给予NLG919治疗组每天灌胃给药。正常对照组及EAE+溶媒组小鼠自发病后第1天开始连续7天,每日给予等量的生理盐水及1.5%羧甲基纤维素钠每日灌胃给药。3.神经功能评分。自免疫后的第1天起,分别由两名实验员在两个时间点采用双盲法于每天早晚(8:00和16:00)两次对小鼠进行神经功能评分并称重。神经功能评分使用的是Knoz 5分评分法。4.病理组织学观察。用HE染色观察实验小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况。用透射电镜观察实验小鼠脊髓腰膨大髓鞘、轴突及线粒体的变化情况。5.用Western Blot的方法,检测各组实验小鼠脊髓腰膨大淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)表达水平的变化和髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)表达水平的变化。6.ELISA评估炎性细胞因子IFN-丫,IL-10,IL-17A,TGF-β1表达水平的变化,评估氧化应激因子8-OHdG表达水平的变化,评估外周细胞凋亡因子Caspase-8表达水平的变化7.流式细胞术评估外周免疫调节细胞Tregs表达水平的变化。8.统计学分析。采用SPSS21.0统计软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。应用Student’s t检验进行两组之间差异的统计学分析,三组或更多组之间的统计学差异通过单因素方差分析及Newman-Keuls多重比较检验来分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.NLG919对EAE小鼠的干预使EAE小鼠的临床症状恶化,增加EAE小鼠神经功能学评分;2.NLG919药物对EAE小鼠的干预可以加重中枢神经系统(脊髓腰膨大)的炎性细胞的浸润病变;3.NLG919药物对EAE小鼠干预后,通过透射电镜观察,发现NLG919可以加重脊髓腰膨大髓鞘、轴突及线粒体的破坏程度;4.NLG919药物对EAE小鼠的干预使细胞因子TGF-β1表达减少,IL-10增加,显著增加IFN-γ表达,IL-17A表达显示出与IFN-γ相似的趋势;5.NLG919药物对EAE小鼠的干预使8-OHdG产生明显增加;6.NLG919药物对EAE小鼠的干预使Caspase-8表达降低;7.NLG919 药物对EAE小鼠的干预使Tregs水平明显降低。第二部分 吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究目的:以C57BL/6雌性小鼠建立多发性硬化的小鼠模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,利用吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂曲尼司特进行干预,观察实验小鼠发病情况,药物的干预作用,应用HE染色、电镜、Western Blot、ELISA、RT-PCR、流式细胞术等方法,从炎性病理改变、代谢、凋亡、氧化应激、免疫调节等多方面研究探讨曲尼司特对EAE小鼠的影响。方法：1.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立。应用周龄为8-10周的C57BL/6雌性小鼠,体重约为18-20g,使用MOG35-55作为免疫抗原,在其中加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)并与一定含量的结核菌素充分混匀,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部多点皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX),即建立完成EAE小鼠模型。2.实验动物的分组及干预。将曲尼司特用1.5%羧甲基纤维素钠制备悬浊液,每天现配现用,自发病第1天开始连续7天,按200mg/kg体重给予曲尼司特治疗组每天灌胃。正常对照组及EAE+溶媒组小鼠自发病后第1天开始连续7天,每日给予等量的生理盐水及1.5%羧甲基纤维素钠每日灌胃给药。3.神经功能评分。自免疫后的第1天起分别由两名实验员在两个时间点采用双盲法于每天早晚(8:00和16:00)两次对小鼠进行神经功能评分并称重。神经功能评分使用的是Knoz 5分评分法。4.病理组织学观察。用HE染色观察实验小鼠脊髓腰膨大处炎性细胞浸润情况。用透射电镜观察实验小鼠脊髓腰膨大髓鞘、轴突及线粒体的变化情况。5.Western Blot评估血清中sCD83表达水平变化。6.RT-PCR评估吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、EISA检测KYN表达水平变化。7.通过ELISA检测评估炎性相关细胞因子IFN-γ,IL-10,IL-17A,TGF-β1的水平变化。8.ELISA评估氧化应激因子8-OHdG表达水平的变化。9.ELISA评估细胞凋亡因子Caspase-8表达水平的变化。10.流式细胞术评估免疫调节细胞Tregs表达水平的变化。11.统计学分析。采用SPSS21.0统计软件(SPSS Inc.,Chicag,,IL,USA)进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”(x ±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。应用Student’s t检验进行两组之间差异的统计学分析,三组或更多组之间的统计学差异通过单因素方差分析及Newman-Keuls多重比较检验来分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.曲尼司特治疗显著降低了 EAE小鼠平均最大神经学评分,曲尼司特治疗组小鼠的病程缩短并且恢复加快。2.EAE溶媒组实验小鼠病理组织切片HE染色呈现出弥漫性的炎性细胞浸润,EAE+曲尼司特组炎性细胞明显减少。在EAE-曲尼司特组小鼠中观察到较轻的髓鞘破坏、轴突退化变性及轻度损伤的线粒体。3.用Westernblot在血液中检测各组sCD83水平,结果显示,EAE-曲尼司特组sCD83水平升高,但与EAE-Veh组相比,差异无统计学意义。4.用RT-PCR评估吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、ELISA检测KYN表达水平变化,评估色氨酸犬尿氨酸代谢途径活化活性。结果显示,与EAE-Veh组相比,曲尼司特处理组小鼠的IDO mRNA和KYN表达显著增加。5.ELISA评估炎性细胞因子表达水平的变化,结果显示,EAE-Veh相比,曲尼司特治疗显著降低IFN-γ表达,不同组中的IL-17A表达显示出与IFN-γ相似的趋势。曲尼司特组TGF-β1的表达略低于EAE-Veh组。曲尼司特组中IL-10的水平升高最显著,各组间差异具有统计学意义。6.ELISA评估氧化应激因子表达水平的变化,结果显示,EAE-Veh组的8-OHdG水平显著高于对照组及曲尼司特处理组。7.ELISA评估细胞凋亡因子表达水平的变化,结果显示,EAE-曲尼司特组中的Caspase-8表达与EAE-Veh组及对照组相比显著增加。8.流式细胞术评估免疫调节细胞表达水平的变化,结果显示,曲尼司特组Tregs数量显著高于对照组及EAE-Veh组。第三部分 硫辛酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠作用的研究目的:以C57BL/6雌性小鼠建立多发性硬化的小鼠模型即实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型,以可溶性CD83-吲哚胺-2,3-双加氧酶-色氨酸犬尿氨酸途径为基础,用抗氧化剂硫辛酸进行干预,观察实验小鼠发病情况以及药物的干预作用,应用Western Blot、ELISA、RT-PCR、流式细胞术等方法,从炎性改变、代谢、免疫调节等多方面研究探讨硫辛酸对EAE小鼠的影响。方法:1.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立。应用周龄为8-10周的C57BL/6雌性小鼠,体重约为18-20g,使用MOG35-55作为免疫抗原,在其中加入等体积的完全弗氏佐剂(CFA)并与一定含量的结核菌素充分混匀,使结核杆菌H37Ra的终浓度为4mg/ml,给予小鼠背部多点皮下注射,并分别于免疫的当天及第2天,分别分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX),即建立完成EAE小鼠模型。2.实验动物的分组及干预。硫辛酸溶解于l00mM pH7.4的Tris缓冲液中,每天现配现用,自发病第1天开始连续7天,按100mg/kg体重给予硫辛酸治疗组每天腹腔注射。正常对照组及EAE+溶媒组小鼠自发病后第1天开始连续7天,每日给予等量的生理盐水及Tris缓冲液每日腹腔注射给药。3.用R-PCR评估吲哚胺2,3-双加氧酶(1DO)、ELISA检测KYN表达水平变化。4.通过ELISA检测评估炎性相关细胞因子TNF-α、IL-10,TGF-β1的水平变化。5.应用Westem-blot检测EAE小鼠疾病不同状态的血清sCD83 水平。6.应用流式细胞术检测各组实验小鼠全血中Tregs细胞的数量及CD4+CD83+T细胞的数量。7.统计学分析。采用SPSS21.0统计软件(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。计量资料以“均数±标准差”(x±s)表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验。应用Student’s t检验进行两组之间差异的统计学分析,三组或更多组之间的统计学差异通过单因素方差分析及Newman-Keuls多重比较检验来分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.RT-PCR评估吲味胺2,3-双加氧酶(IDO)、ELISA检测KYN表达,结果分析显示,急性期EAE溶媒组小鼠的IDO mRNA和KYN表达较硫辛酸处理组显著增加。2.应用ELISA检测评估炎性相夫细胞因于TNF-α、IL-10,TGF-β1的水平,结果分析显示,硫辛酸治疗组与同期EAE溶媒组相比,TNF-α表达显著减少,TGF-β的表达量增加,IL-10水平明显升高。3.应用western-blot检测EAE小鼠疾病不同状态的血清sCD83水平,分析结果显示,与急性期溶媒组EAE组相比,硫辛酸处理组sCD83水平稍降低。4.用流式细胞术检测实验小鼠全血中Tregs细胞的数量、及CD4+CD83+T细胞的数量,结果分析显示,与急性期EAE溶媒组相比,硫辛酸处理组EAE的Tregs细胞数量显著增加;与急性期EAE溶媒组相比,硫辛酸处理组CD4+CD83+T细胞的数量减少。结论:1.吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂NLG919恶化EE病情,加重病理损伤,可能机制为:促进炎症反应及氧化应激,抑制外周细胞凋亡,减少免疫调节细胞的产生。2.吲哚胺-2,3-双加氧酶激动剂曲尼司特改善EAE病情,减轻病理损伤,可能机制为:抑制炎症反应及氧化应激,促进外周细胞凋亡,增加免疫调节细胞及分子的产生。3.硫辛酸使色氨酸犬尿氨酸代谢活性相对降低,抑制炎症反应,促进免疫调节分子SCD83相对表达增多,使外周Tregs细胞及CD4+CD83+T细胞数量增加。