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烟草作为一种特殊的经济作物,每年为国家经济发展作出了重要贡献。2007年烟草行业工商税利超过3880亿元,同比增长25%。但是烟草生产上受许多病虫害的侵染而影响烟叶产量和品质。烟草青枯病是影响南方烟区发展的一个重要因素之一,长期以来未能得到有效的解决。本研究采用了分子生物学、生物信息学技术和基因工程手段进行烟草抗青枯病的分子育种研究,克隆得到了烟草根特异表达基因的启动子,进行了遗传鉴定;从拟南芥上克隆了抗病基因,构建了由根特异表达启动子和诱异表达启动子引导的特异表达载体,正用于转化烟草。主要结果如下:1.从烟草根和叶片的SSH文库中获得了5个差异基因,利用半定量RT-PCR方法初步分析这5个差异基因的表达模式,结果显示NtR12、NtR14、NtR17、NtR18和NtR19基因在旺长期的材料中,只在根部表达;但在含有各生育期根组织和胁迫诱导的根组织混合材料中,NtR19基因仅在根部表达,而NtR12基因在叶片中不表达,故NtR12和NtR19是最好的候选基因,NtR17和NtR18基因在根部表达量相对比在茎、叶、花、果的大,可能显示两个基因的表达与生育期和环境胁迫有关。2.以烤烟品种K326根总RNA为模板,采用改良的5’ RACE获得烟草根基因NtR18的5’端序列;通过3’RACE和5’RACE亦得到了NtR19基因的全长序列;通过网上已报道的它植物的mRNA全长进行生物信息学预测了NtR12、NtR17和NtR14基因的全长序列,这些基因的全长分别是798bp、604bp、801bp、1422bp、867bp。为进一步获得其上游启动子序列奠定了基础。3.通过本实验室改良的Flanking PCR技术,已分别克隆得到了NtR12、NtR17、NtR18和NtR19基因的上游启动子序列,其长度分别为956bp、1037bp、924bp和1230bps。利用生物信息学软件对这些基因进行初步分析表明,它们均含有TATA盒和CAAT等公共启动子区域。4.为鉴定启动子的表达特异性,构建了先得到的NtR12启动子驱动GUS基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转烟草,通过Kan筛选获得转基因植株,取转基因幼苗的根、茎和叶进行GUS基因活性检测,结果显示GUS基因仅根中特异表达,这与半定量PCR结果基本一致。因而从遗传上初步确定了NtR12启动子属根特异表达启动子。5.为提高烟草的抗病抗逆性,从拟南芥上克隆了NPR1、WRKY60和CBF2抗病抗逆基因,经测序分析表明这些基因的全长分别为1782bp、816bp和651bp,与网上报道的完全一致。利用本研究已得到的启动子和本实验室已有的细胞诱导表达启动子,在pCAMBIA载体上,分别构建了带NtR12和PP1启动子驱动的表达载体,这些载体正用于对烟草的遗传化研究。目前烟草根特异表达启动子很少,尚未见实际应用,本研究克隆的烟草根特异表达启动子和抗病基因,可通过基因因工程解决抗青枯病问题提供了基础,有重要的理论和应用价值。