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目的:通过观察健脾祛痰化瘀法对脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小猪心肌细胞线粒体的能量代谢的影响,以氧化应激为切入点,探讨健脾祛痰化瘀法改善脾虚痰浊动脉粥样硬化的巴马小型猪心肌损伤的作用机制。材料与方法:健康巴马小型猪15只,月龄6-8个月,随机分为正常组、模型组、健脾祛痰化瘀组3组,每组5只。造模:正常对照组予基础饲料喂饲,模型组、健脾祛痰化瘀组采用高脂高热量喂养,喂养第3周,模型组与健脾祛痰化瘀组予冠状动脉球囊拉伤手术干预建立动脉粥样硬化模型,第6周加入跑步机跑步过劳,建立脾虚模型[1],共喂养48周。药物干预:高脂喂饲24周后健脾祛痰化瘀组予健脾祛痰化瘀方药搅拌于饲料中喂食。第48周末取心肌组织。油红O染色观察模型组心肌脂肪形成情况,HE染色观察巴马小型猪心肌细胞的变化,电镜观察心肌细胞线粒体的变化;比色法观察心肌细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和ATP的含量,PCR array的方法观察各组巴马小型猪心肌线粒体能量代谢通路相关基因m RNA表达,Na+-K+-ATP酶和ATP5F1酶的活性观察心肌线粒体的能量变化;检测各组巴马小型猪的心肌线粒体ROS、CAT、MDA、GSH-PX的含量;检测各组巴马小型猪心肌细胞Bax、Bcl-2、细胞色素C、Caspase3的含量。结果:1健脾祛痰化瘀法对脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小型猪心肌形态的影响1.1油红O染色后脂肪成红色,细胞核成蓝色,间质无色。心肌油红O显色表示:正常组心肌细胞排列有序,无橘红色的脂肪细胞浸润。与正常组比较,模型组心肌细胞内呈现油红着色,脂滴多。与模型组比较,中药治疗组心肌脂粒明显减少。1.2在光镜下,正常组巴马小型猪心肌细胞为短圆柱型并有分支,细胞核位于中央,成椭圆形,心肌细胞轮廓清晰,胞浆可见肌原纤维平行排列心肌细胞无炎性浸润。模型组巴马小猪心肌细胞出现炎性浸润,心肌纤维肿胀,甚至出现坏死区。与模型组比较,中药治疗组心肌细胞炎性浸润,心肌纤维肿胀,坏死明显减少。1.3电镜下,正常组心肌纤维排列整齐,线粒体数量和形体正常,可见完整的细胞核、线粒体。Z线清楚,肌纤维间线粒体较多,肌节清晰、核仁明显。线粒体无融合、肿胀、变形等。模型组心肌纤维排列较紊乱,心肌细胞核形极不规则,闰盘较为紊乱。心肌细胞结构模糊,肌纤维部分溶解断裂,Z线清楚,心肌纤维间线粒体部分嵴减少或外膜局部破损,线粒体肿胀内质网空泡变性。肌纤维部分变性、断裂,甚至溶解,提示模型制备成功。中药治疗组心肌纤维排列整齐,Z线清楚,肌纤维间线粒体较多,但线粒体部分外膜局部破损,可见心肌闰盘。2健脾祛痰化瘀法对脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小型猪心肌线粒体能量代谢的影响2.1巴马小型猪心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性的检测:各组巴马小型猪心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性比较,与正常组相比,模型组巴马小型猪心肌线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性下降,但无统计学差异(P>0.05),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调,但无明显统计学差异(P>0.05)。2.2巴马小型猪心肌线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性的检测:各组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性比较,与正常组相比,模型组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性明显下降(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调(P<0.05)。2.3巴马小型猪心肌线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性的检测:各组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性比较,与正常组相比,模型组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性明显下降(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调(P<0.05)。2.4巴马小型猪心肌线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性的检测:各组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性比较,与正常组相比,模型组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性明显下降(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调(P<0.05)。2.5巴马小型猪心肌线粒体呼吸链复合物Ⅴ活性的检测:各组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅴ活性比较,与正常组相比,模型组心肌线粒体呼吸链复合物Ⅴ活性明显下降(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调(P<0.01)。2.6巴马小型猪心肌线粒体ATP活性的检测:各组心肌线粒体ATP活性比较,与正常组相比,模型组心肌线粒体ATP活性明显下降(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,总要治疗组显著上调(P<0.01)。2.7 PCR array法检测线粒体能量代谢相关基因m RNA的表达:与正常组相比,模型组线粒体能量代谢相关基因m RNA的表达有生物学意义的变化的基因上调≥4倍的基因有9个,分别是:DNAJB1、OXA1L、NDUFA6、NDUFB8、NDUFB9、NDUFS2、NDUFS8、PPA2、NNT,占总基因数的10%,下调≥4倍的基因有17个,分别是:ATP5A1、ATP5L、ATP5F1、ATP4A、ATP6V1E2、ATP6V0A2、ATP6V1C2、ATP6V1G3、ATP6V0D2、ATP12A、BCS1L、SDHA、SDHB、LHPP、NDUFS1、SDHD、SLC25A15,占总基因数的20%。中药治疗后与模型组相比,下调的≥4倍基因有2个,分别是:NDUFB3、NDUFC2,占总基因数的2%,上调的≥4倍基因有7个,分别是:ATP5A1、ATP5F1、ATP6V1E2、ATP5E、ATP6V0A2、SDHC、SDHD占基因综述的8%。其中、ATP5F1、ATP5E两个基因变化的最明显。2.8巴马小型猪心肌Na+-K+-ATP酶表达的检测:模型组Na+-K+-ATP酶表达较正常组明显减少(P<0.01),中药治疗组Na+-K+-ATP酶的活性与模型组比较明显升高(P<0.01)。2.9巴马小型猪心肌ATP5F1蛋白表达的检测:模型组ATP5F1蛋白表达较正常组明显减少(P<0.01),中药治疗组ATP5F1的表达与模型组比较明显升高(P<0.01)。3健脾祛痰化瘀法通过影响线粒体氧化应激改善脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小型猪心肌细胞凋亡。3.1巴马小型猪心肌ROS含量的检测:各组心肌ROS含量比较,与正常组相比,模型组心肌线粒体ROS含量明显上调(P<0.05),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著下调(P<0.01)。3.2巴马小型猪心肌MDA含量的检测:各组心肌MDA含量比较,与正常组相比,模型组心肌MDA含量明显上升(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著下调(P<0.01)。3.3巴马小型猪心肌GSH-PX含量的检测:各组心肌GSH-PX含量比较,与正常组相比,模型组心肌GSH-PX含量明显下调(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调(P<0.05)。3.4巴马小型猪心肌CAT含量的检测:各组心肌CAT含量比较,与正常组相比,模型组心肌CAT含量明显下调(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调(P<0.01)。3.5巴马小型猪心肌Bax蛋白表达的检测:各组心肌Bax蛋白表达比较,与正常组相比,模型组心肌Bax含量明显上调(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著下调(P<0.05)。3.6巴马小型猪心肌Bcl-2蛋白表达的检测:各组心肌Bcl-2蛋白表达比较,与正常组相比,模型组心肌Bcl-2明显下调(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著上调Bcl-2含量(P<0.01)。3.7巴马小型猪心肌Cyto C蛋白表达的检测:各组心肌Cyto C蛋白表达比较,与正常组相比,模型组心肌Cyto C蛋白含量明显上调(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著下调(P<0.01)。3.8巴马小型猪心肌Caspase3蛋白表达的检测:各组心肌Caspase3含量比较,与正常组相比,模型组心肌Caspase3含量明显上调(P<0.01),药物干预之后与模型组比较,中药治疗组显著下调(P<0.01)。结论:1.同课题组的研究已经完成了脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小型猪模型的建立和评价。健脾祛痰化瘀法减少了脾虚痰浊动脉粥样硬化所致的巴马小型猪心肌线粒体的损伤。2.健脾祛痰化瘀法可以增加线粒体电子传递链上复合物的活性,增加ATP合成,改善线粒体能量代谢来减轻脾虚痰浊动脉粥样硬化对心肌线粒体的损伤从而实现对线粒体功能和结构的保护作用。3健脾祛痰化瘀法可以减少脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马小型猪心肌氧自由基、MDA的生成,增加CAT、GSH-PX的表达,通过其抗氧化的功能,减少了线粒体的氧化应激从而减少巴马小型猪心肌细胞Bax、Cyto C,Caspase3表达,增加Bcl-2的表达,减少心肌细胞损伤。