目的：通过观察人骨髓间充质干细胞(human bone marrow stromal cells, hBMSCs)的复制性衰老进程以及衰老进程中hBMSCs的生物学特征变化,探讨20S蛋白酶体在hBMSCs复制性衰老进程中的调控作用,从而揭示hBMSCs复制性衰老的机制,以期为hBMSCs的临床应用提供指导依据。方法：体外培养hBMSCs,依据传代次数将细胞分为早期组(1-3代)、中期组(7-9代)和晚期组(12-14代)：(1)倒置相差显微镜下观察不同时期细胞形态特征,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老进程,噻唑蓝(MTT)比色分析法和溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入实验检测细胞增殖能力。(2)免疫荧光染色观察20S蛋白酶体在hBMSCs复制性衰老进程中的表达变化。(3)将10μM蛋白酶体特异性抑制剂MG132作用于早期hBMSCs,每日作用2h,反复刺激4d,随后通过β-半乳糖苷酶染色,观察衰老标志物β-半乳糖苷酶的表达变化,并应用MTT比色法和BrdU掺入实验检测细胞增殖活性,检测蛋白酶体抑制剂对早期hBMSCs增殖能力的影响。结果：(1)早期hBMSCs胞体较小、核仁清晰,细胞呈梭形,似成纤维细胞样外形。伴随体外传代次数增多hBMSCs胞体变大、突起增多,细胞折光度降低,胞浆内出现许多细小颗粒,细胞粘附能力增加,生长速度减慢。衰老标志物β-半乳糖苷酶染色结果显示,早期、中期和晚期组阳性细胞率分别为9%±7%,54%±8%,90%±8%,三组之间比较p<0.05,提示体外培养的hBMSCs存在复制性衰老。MTT比色法检测不同培养阶段hBMSCs细胞活力早期组OD值为0.61±0.04,中期组为0.53±0.05,晚期组为0.37±0.03,三组之间比较p<0.05,表明在复制性衰老进程中细胞活力显著降低,同时BrdU掺入实验结果也表明晚期组细胞BrdU阳性率(8%±2%)较早期组(73%±11%)显著降低,且p<0.05,进一步表明在复制性衰老进程中hBMSCs增殖活力降低。(2)免疫荧光染色结果显示hBMSCs表达20S蛋白酶体,早期组与中期组20S蛋白酶体阳性率为100%,然而晚期细胞20S蛋白酶体表达水平降低,其阳性率降至31%,提示蛋白酶体活性降低可能与hBMSCs复制性衰老有关。(3)早期hBMSCs经MG132作用后β-半乳糖苷酶染色增强,β-半乳糖苷酶阳性率达87%±13.2%,较DMSO组(对照组)(19%±6.8%)明显升高,且p<0.05,MTT检测结果证实MG132组OD值(0.36±0.06)较DMSO组(0.47±0.08)显著降低,且p<0.05,并且Brdu掺入实验也显示MG132组Brdu阳性率(7%±2%)较对照组(54%±4%)明显降低,且p<0.05,表明蛋白酶体抑制剂可诱导早期hBMSCs出现衰老细胞的表型,进一步说明蛋白酶体活性降低与hBMSCs复制性衰老有关。结论：(1)体外培养的hBMSCs存在复制性衰老；(2)20S蛋白酶体在hBMSCs复制性衰老进程中表达水平降低。(3)应用蛋白酶体特异性抑制剂可诱导hBMSCs呈现衰老细胞的表型,提示蛋白酶体活性降低可能是导致hBMSCs衰老的重要原因。