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背景缺血性脑血管疾病(Ischemic cerebral vascular disease,ICVD),中医学归属于“中风”、“缺血性中风”等范畴,是临床常见的致残乃至致死的危急重病之一,严重威胁着人类的身体健康和生命安全。随着我国的人口老龄化,以及人们的生活习惯、饮食结构的改变,中老年及青年人的中风发病率皆在增加。近年来,对脑卒中各方面的研究已取得进展。免疫系统是机体防御病原体入侵的重要防护屏障,其机能亢进则会对危害自身组织及器官。目前,对免疫学的研究已远远超出以往只针对感染防御的范畴,免疫机制在脑卒中的发病机制中逐步得到重视。本课题的前期临床研究表明,健脾补肾活血方能明显提高脑梗死患者的日常生活能力,临床疗效确切。故本课题在之前临床研究基础之上,把SPF级雄性SD大鼠作为实验研究对象,制作成大鼠MCAO脑缺血再灌注模型,通过检测大鼠的神经功能评分、各大鼠的脑梗死面积之比、大鼠脑组织中T淋巴细胞亚群CD3~+、CD4~+和CD8~+淋巴细胞在不同时间点的动态变化来探讨具有扶正固本之功的健脾补肾活血方对脑缺血大鼠脑组织局部免疫炎症反应的影响及其脑保护的作用机制,为临床治疗缺血性脑血管病提供科学依据。目的1、通过检测大鼠MCAO脑缺血再灌注后不同时间点的神经功能评分、脑梗死的面积之比、大鼠脑组织中CD3~+、CD4~+和CD8~+淋巴细胞在不同时间点的动态变化,以寻求最佳干预时间窗。2、探讨健脾补肾活血方在免疫应答干预情况下对脑缺血再灌注后继发性脑组织损伤的保护作用机制。方法健康成年雄性SD大鼠144只,体重250-300g,将其随机分为中药组、西药组、模型组和假手术组,采用Zea-Longa线栓法制作MCAO模型,各组均设I/R3h、6h、1d、3d、7d、14d总共6个时间点进行动态观察,每组每个时间点6只。假手术组仅仅不插入线栓,亦按相同时间点观察。中药及西药组在造模前5d及造模后的观察期间均依照1ml/100g的量分别灌胃健脾补肾活血方药液和尼莫地平混悬液。待大鼠麻醉苏醒后按照Zea-Longa 5分制的标准评分方法进行神经功能缺损评分,评分1-3分为造模成功,并记录其分数;各组大鼠达再灌注时间点后进行断颈取脑,切取脑组织,采用TTC染色法测定各大鼠脑梗死面积之比;HE染色观察脑组织缺血再灌注的病理学形态;运用免疫组织化学染色法(IHC)显示CD3~+、CD4~+和CD8~+淋巴细胞的空间分布和时间变化,每个切片选取目标区(以缺血皮质区为主),在400倍的光镜下随机选取不重叠的视野5个并拍照,计数阳性细胞数(胞膜棕黄色),计算5个视野的平均数即是此片的阳性细胞数。结果1、各组大鼠神经功能评分:因假手术组大鼠均未闭塞其大脑中动脉,故未出现神经功能缺损症状,其神经功能评分均为0分,其余三组大鼠的神经功能评分均随脑缺血再灌注时间的延长先逐渐升高后减低,I/R3d的神经功能评分均高于I/R3h、6h、1d、7d、14d(P<0.05);模型组的神经功能评分均高于尼莫地平组和健脾补肾活血方组(P<0.05);尼莫地平组的神经功能评分高于健脾补肾活血方组(P<0.05)。2、各组大鼠在不同时间点脑梗死面积比:因假手术组大鼠未对其进行大脑中动脉闭塞模型的制造,为健康大鼠,故脑梗死面积均为0;除假手术组,其余三组大鼠造模成功后在其缺血侧大脑半球均可出现不同程度的梗死,TTC染色可见梗死区为大小不等的苍白病灶,而正常区域的脑组织为均匀红色。三组大鼠在不同时间点的脑梗死面积各不相同,均在I/R7d时脑梗死面积最大,不同时间点之间比较差异具有统计学意义(P<0.05);健脾补肾活血方组及尼莫地平组的脑梗死面积小于模型组(P<0.05);健脾补肾活血方组的脑梗死面积小于尼莫地平组(P<0.05)。3、脑组织缺血再灌注病理学形态:假手术组脑组织正常,结构完整存在,未见缺血或变性改变。其余三组的缺血梗死灶主要位于额叶、顶叶的皮质及纹状体尾部的壳核,在I/R1d时可见明显梗死灶;在I/R3d时缺血皮质表现为组织结构紊乱,淡染,增厚,神经元水肿变性较I/R1d数量多且明显;I/R7d时缺血皮质正常形态神经细胞数目明显减少,核固缩、溶解,胞质及胞核界限模糊不清,胞间可见大小不等空泡。神经细胞数量极少,中心坏死区可见大量呈蜂窝状的空泡;I/R14d时缺血区皮质空泡数量骤增,坏死组织被清除。4、免疫组化观察CD3~+、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞分布:假手术组几乎无阳性细胞的表达。其余三组均在I/R6h发现有极少量的CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞聚集于脑组织皮质梗死边缘;I/R3d在反应带及坏死中心周围可见到大量CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞;I/R7d时CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的数量最多,且多位于中心坏死区;然而在I/R14d观察到CD3~+、CD8~+T淋巴细胞的数量有所下降。CD3~+阳性细胞较CD8~+阳性细胞出现稍晚。在相同时间点CD3~+、CD8~+细胞的数量为模型组大于西药组,西药组大于中药组,而CD4~+细胞为中药组大于西药组,西药组大于模型组。结论1、健脾补肾活血方能显著改善缺血/再灌注后各大鼠神经功能评分,缩小脑梗死的面积;减少大鼠脑组织中CD3~+和CD8~+T淋巴细胞数目,增加CD4~+细胞的数目。2、健脾补肾活血方能通过抑制CD3~+、CD8~+和调节CD4~+淋巴细胞在缺血/再灌注损伤之后脑组织内的进一步侵润,从而减少免疫应答所介导神经细胞的凋亡,最终减轻脑组织的继发性损伤。