第一章BRL大鼠肝细胞HSP70的表达及意义目的：通过热休克预处理提高BRL大鼠肝脏细胞HSP70的表达水平,建立体外实验研究的热休克模型。方法：选择生长良好的且未铺满培养瓶底的BRL大鼠肝细胞做热休克反应。从37℃C02培养箱中拿出培养瓶,放入预设温度(40～50℃)的水浴箱中,孵育30′后,再放入培养箱复温培养。分别培养2h后测细胞成活率,选择成活率在95%以上的温度再进一步进行热处理30′后37℃培养48小时,再次测定细胞成活率,发现40～42℃水浴30′,37℃培养48h后细胞成活率在95%以上。BRL大鼠肝脏细胞40～42℃热处理30′后分别培养2h、8h、12h、24h、48h,用Western-blot检测HSP70蛋白表达情况。正常BRL大鼠肝细胞用不同浓度的谷氨酰胺、槲皮素分别进行培养2h后,42℃热浴30′,于培养2h、8h、12h、24h、48h后测细胞成活率及用Western-blot检测HSP70蛋白、GR蛋白表达情况。分组：37℃培养BRL大鼠肝细胞为正常对照组,42℃热处理BRL大鼠肝细胞30′为热休克组,槲皮素、谷氨酰胺培养肝细胞2h再热处理分别为槲皮素干预组、谷氨酰胺干预组。结果：40～42℃热处理BRL大鼠肝细胞30′后,37℃培养48h细胞的成活率大于95%。正常BRL大鼠肝细胞HSP70含量较低,热处理后2hHSP70表达迅速增加,8h明显升高,12h达到顶峰,24小时仍处在较高水平,48h稍高于正常。40℃、41℃、42℃热处理后BRL大鼠肝细胞HSP70的表达在各时相点均高于正常对照组(P＜0.05),发现在42℃2h、8h、12h、24hHSP70的表达明显高于40℃、41℃(P＜0.05),48小时稍高于40℃、41℃(P＞0.05)。41℃各时相点HSP70表达均高于40℃,但无显著性差异(P＞0.05)。因此选用42℃热处理30′做为BRL大鼠肝细胞的热休克反应温度及时间。用不同浓度的谷氨酰胺培养肝细胞2h、42℃热处理30′,37℃培养2h后检测HSP70表达,发现浓度为8mmol／L谷氨酰胺诱导HSP70表达最高；用不同浓度的槲皮素培养肝细胞2h,然后42℃热处理30′,37℃培养2h,发现150umol／L浓度槲皮素干预后HSP70表达最低。分别用浓度8mmol／L谷氨酰胺、150umol／L浓度槲皮素培养肝细胞2h后进行热休克反应并检测2h、8h、12h、24h、48hHSP70、GR的表达。谷氨酰胺干预组HSP70的表达在各时相点均显著高于正常对照组(P＜0.05)；与热休克组相比,在8h、12h、24h有显著性差异(P＜0.05)。槲皮素干预组HSP70的表达在2h、8h时相点显著低于正常对照组(P＜0.05),12h、24h稍低于正常组,48h接近正常(P＞0.05)。谷氨酰胺干预组HSP70的表达在各时相点均显著高于槲皮素干预组(P＜0.05)。谷氨酰胺干预组各时相点细胞成活率均高于95%,槲皮素干预组细胞成活率2h、8h明显降低,12小时后逐渐升高,48h仍低于85%。BRL大鼠肝细胞42℃热休克30′后37℃培养,在各时相点GR表达均较正常对照组下降,2h开始下降,8h下降明显,12h降至最低,24小时仍较低,48h接近正常。8mmol／L谷氨酰胺干预组在各时相点GR均较热休克组有所下降,8h、12h有显著性差异(P＜0.05)；150umol／L槲皮素干预组在各时相点GR均较正常组下降,2h、8h较热休克组有轻度升高,但无统计学意义；槲皮素干预组GR表达较谷氨酰胺干预组在2h、8h有所升高(P＜0.05)。结论：(1)正常BRL大鼠肝细胞HSP70表达较低,42℃热处理30′方法可以成功诱导BRL大鼠肝细胞高表达HSP70,此方法不会导致连续培养48h后细胞成活数量的明显变化,成功建立了BRL大鼠肝细胞热休克模型。(2)谷氨酰胺可以诱导HSP70的高表达,对细胞有保护作用,槲皮素可以明显抑制HSP70的表达,导致细胞成活数量的明显降低。8mmol／L谷氨酰胺、150umol／L槲皮素分别为诱导、抑制HSP70表达的最佳浓度,并为动物实验提供剂量参考。(3)热休克反应及谷氨酰胺可以诱导BRL大鼠肝细胞HSP70高表达,GR呈低表达。槲皮素干预后,GR也呈低表达,但较谷氨酰胺干预组有所升高。在热休克反应中HSP70与GR有一定的负相关,HSP70调节GR的活性,两者关系有待进一步研究。第二章不同切肝量大鼠HSP70的表达及意义目的：检测大鼠不同程度手术创伤后血清及肝脏组织中HSP70的表达,研究HSP70与手术创伤程度、创伤致内环境及肝功能改变、GC、GR之间的关系,探讨HSP70评价手术创伤程度及对内环境稳态、肝脏的保护作用及机制。方法：1.动物模型建立：雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为(1)正常对照组：大鼠不作任何手术处理。(2)手术创伤组：①轻度创伤组：大鼠肝脏左外叶切除组；②中度创伤组：大鼠肝脏左外叶和右叶切除组；③重度创伤组：大鼠肝脏左外叶、右叶、乳头叶和尾状叶切除组。(3)谷氨酰胺干预组：在手术前2h尾静脉推注0.75g／kg谷氨酰胺,分为谷氨酰胺干预轻度创伤组、谷氨酰胺干预中度创伤组、谷氨酰胺干预重度创伤组。(4)槲皮素干预组：在手术前2h腹腔注入7mg／kg,分为槲皮素干预轻度创伤组、槲皮素干预中度创伤组、槲皮素干预重度创伤组。(5)米非司酮干预组：在手术前2h肌肉注射5mg／kg米非司酮,分为米非司酮干预轻度创伤组、米非司酮干预中度创伤组、米非司酮干预重度创伤组。每一程度创伤组有50只大鼠,在5个时间点(术后2h、8h、12h、24h、48h)进行分批处理大白鼠(每时间点均为10只),每组大鼠在同样的环境中饲养,不同组间及时间点间大鼠体重、年龄无差异。2.指标检测：分别采取正常对照组、手术创伤组及干预组各组术前、术后2h、8h、12h、24h、48h血液标本及肝脏组织,用ELISA法检测血清HSP70水平,用血气分析仪检测血PH,全自动生化仪检测血K+、Na+及Ca2+浓度；化学发光仪检测血清皮质醇含量；用western-blot、实时荧光定量PCR检测大鼠肝脏组织HSP70、HSP70mRNA及GR、GRmRNA表达变化情况。结果：(1)模型的成功建立：采用对SD大鼠行肝叶切除术成功建立不同程度手术创伤的模型,手术轻度创伤组、中度创伤组、重度创伤组大鼠存活率分别为98.0%、94.0%、92.0%,组间比较无显著性差异(P＞0.05),为研究不同程度手术创伤对机体的影响建立了动物模型。(2)血清HSP70的表达：①手术创伤组：手术创伤后2h血清HSP70表达开始增加,12h达到高峰,以后逐渐下降,48h仍高于正常水平。随着手术创伤程度的增加血清HSP70表达水平均升高；术后8、12、24h时相点轻度、中度、重度创伤组之间比较有显著差异性(P＜0.05)。血清皮质醇于术后2h迅速增加,8h达到高峰,24小时仍有较高浓度,48h略高于正常。随着手术创伤程度的增加,皮质醇浓度亦增加,术后2、8、12、24h时相点轻度、中度、重度之间比较有显著差异(P＜0.05)。②谷氨酰胺干预组：在每一时相点较手术创伤组血清HSP70的表达均增加,在术后8、12、24h时相点增加明显,差异有显著性(P＜0.05)。与手术创伤组比较,每一时相点皮质醇浓度均有所下降,在术后2、8、12h有显著性差异(P＜0.05)。③槲皮素干预组：较手术创伤组相应的各时相点HSP70表达均有所下降,在术后2、8、12、24h下降明显(P＜0.05),但组内之间无显著性差异；与手术创伤组相比各时相点的皮质醇浓度有所增加,在术后2、8、12h有显著性差异(P＜0.05)。与谷氨酰胺干预组相比在各时相点HSP70均显著下降(P＜0.05)；而皮质醇浓度有所升高,在术后2、8、12、24h差异有显著性(P＜0.05)。④米非司酮干预组：较手术创伤组相对应的各时相点血清HSP70表达和皮质醇浓度均明显升高(P＜0.05)。与槲皮素干预组相比,HSP70表达和皮质醇浓度在每一时相点都显著升高,差异有显著性(P＜0.05)。(3)肝功能的变化：①手术创伤组：不同程度的手术创伤术后随着时相延长ALT、TB有增高趋势,24h高峰,以后开始下降；随着创伤程度的增加,每一时相点ALT升高明显(P＜0.05)；在术后8、12、24h随着创伤程度的增加,TB升高明显(P＜0.05)；轻度创伤组术后8h、12h、24h ALT高出正常范围,TB均正常；中度、重度创伤术后每一时相点ALT均显著高出正常范围,中度创伤术后8h、12h、24h及重度创伤术后8h、12h、24h、48hTB高于正常。②谷氨酰胺干预组：手术创伤组异常ALT、TB指标经谷氨酰胺干预后均有明显改善,但中度创伤术后12h、24h及重度创伤术后8h、12h、24h的ALT虽然明显下降,仍高于正常。中度创伤术后24h、重度创伤术后12h、24hTB略高于正常外,其余各时相TB均恢复正常。③槲皮素干预组：与手术创伤组相比在相同创伤程度下ALT在(2、8、12、24h)、TB在中度(24h)及重度(12、24h)时相点差异有显著性(P＜0.05)。槲皮素干预组与谷氨酰胺干预组相比,ALT在轻度(2、8、12、24h)、中度及重度各时相点差异有显著性差异(p＜0.05)；TB在轻度(24h)、中度(8、12、24、48h)、重度每一时相点差异有显著性差异(p＜0.05)。④米非司酮干预组：手术创伤组各时相点的异常ALT经米非司酮干预后均有明显升高(P＜0.05),TB在术后8、12、24h升高明显(P＜0.05)。与谷氨酰胺干预组相比ALT在每一时相点、TB在轻度(12、24h)中度(8、12、24、48h)及重度各时相点有显著性差异(P＜0.05)；与槲皮素干预组相比ALT在(8、12、24h)、TB在重度(12、24h)时相点有显著性差异(P＜0.05)。(4)手术创伤组术后内环境的变化(一)K+的变化：①手术创伤组：手术创伤术后K+均迅速下降,至2h明显降低,后逐渐上升恢复至正常水平；在术后2h K+浓度随创伤程度增加而下降明显(P＜0.05)。②谷氨酰胺干预组：术后2h K+有所升高,中度创伤组至正常水平,重度创伤组接近正常(P＜0.05)。③槲皮素干预组：较手术创伤组在各时相点K+有所下降,术后2h K+与手术创伤组、谷氨酰胺干预组比较有显著性差异(p＜0.05)。④米非司酮干预组：术后血K+在各时相点较创伤组、谷氨酰胺组有所下降,在术后2h有显著性差异(p＜0.05)。(二)Na+的变化：①手术创伤组：术后Na+逐渐下降,至12h达最低水平,后逐渐上升至正常水平；在术后12h随创伤程度增加而下降明显(p＜0.05)。②谷氨酰胺干预组：术后各时相点均较手术创伤组有所上升,轻、中度创伤术后12h Na+恢复至正常,重度组仍稍低于正常。③槲皮素干预组：术后Na+较手术创伤组均有所下降,在术后12h有显著性差异(p＜0.05)。术后12h与谷氨酰胺干预组相比有显著性差异(P＜0.05)。④米非司酮干预组：术后各时相点Na+均较手术创伤组下降,在12h与手术创伤组比较有显著性差异(P＜0.05)。(三)PH：①手术创伤组：重度手术创伤组术后2h降低较明显,低于正常水平,与其余组间有差异(p＜0.05)。②谷氨酰胺干预组：重度创伤组术后2h PH值升为正常。③槲皮素干预组：术后PH在各时相点均有所下降,且中度创伤组术后2hPH低于正常(p＜0.05)。④米非司酮干预组：术后PH在各时相点均有所下降,且轻、中度创伤组术后2hPH也低于正常(p＜0.05)。(5)肝脏组织HSP70和HSP70mRNA的表达①手术创伤组：肝脏组织HSP70和HSP70mRNA的表达有一致性。正常大鼠肝脏HSP70和HSP70mRNA含量较低,术后2h表达增加,12h达到高峰,以后逐渐下降,24h仍维持在较高水平,48h稍高于正常。随着手术创伤程度的增加肝脏组织HSP70和HSP70mRNA表达水平均升高；HSP70在术后8、12、24h时相点轻度、中度、重度之间比较有显著性差异(P＜0.05)；HSP70mRNA在术后2、8、12h时相点轻度、中度、重度之间比较有显著性差异(P＜0.05)。②谷氨酰胺干预组：较手术创伤组在每一时相点肝脏组织HSP70、HSP70mRNA的表达水平均增加,HSP70在术后8、12、24h时相点增加明显(P＜0.05)；HSP70mRNA在术后2、8、12h时相点增加明显(P＜0.05)。与槲皮素干预组相比各时相点HSP70、HSP70mRNA表达均有显著性差异(p＜0.05)。③槲皮素干预组：较手术创伤组各时相点HSP70和HSP70mRNA表达均有所下降,在术后2、8、12、24h下降明显(P＜0.05)。④米非司酮干预组：HSP70表达在术后各时相点均高于手术创伤组(P＜0.05),HSP70mRNA表达在术后2、8、12、24h时相点高于手术创伤组(P＜0.05)；与槲皮素干预组相比HSP70和HSP70mRNA表达在术后各时相点有显著性差异(p＜0.05),肝脏组织的HSP70、HSP70mRNA的表达与血清HSP70的表达在创伤程度及时程上也具有一定的一致性。(6)肝脏组织GR和·GRmRNA的表达：①手术创伤组：肝脏组织GR和GRmRNA的表达有一致性。正常大鼠肝脏GR和GRmRNA有一定含量,术后表达开始下降,8h明显降低,12h达到最低,24h有所恢复仍较低,48h接近正常。在每一时相点GR和GRmRNA的表达均低于正常,随着手术创伤程度的增加肝脏组织中GR和GRmRNA表达水平逐渐下降；术后8、12、24h时相点轻度、中度、重度之间比较有显著差异性(P＜0.05)。②谷氨酰胺干预组：在各时相点GR和GRmRNA表达均较正常有所下降,随着手术创伤程度的增加肝脏组织中GR和GRmRNA表达水平逐渐下降；术后8、12h时相点轻度、中度、重度之间比较有显著性差异(P＜0.05)。与手术创伤组比较在术后8h、12h有显著性差异(P＜0.05)。③槲皮素干预组：在各时相点GR和GRmRNA表达均较正常组下降,较手术创伤组有轻度升高,但无统计学意义。槲皮素干预组较谷氨酰胺干预组在术后8h、12h、24h有所升高(P＜0.05)。手术创伤大鼠肝脏GRmRNA的表达和GR的表达有一致性。结论：(1)在不同程度手术创伤后,血清HSP70和皮质醇随创伤程度增加而升高,两者有正相关性,血清HSP70可作为判断手术创伤程度的指标。(2)手术创伤后大鼠内环境指标Na+、K+、PH值随着HSP70升高逐渐趋于至正常水平；术前谷氨酰胺诱导HSP70的高表达可使手术创伤后内环境指标和肝功能明显改善；HSP70对内环境及肝功能有保护作用。(3)血清HSP70、肝脏HSP70及HSP70mRNA的表达在创伤程度及时程上有一定的一致性,手术创伤后HSP70在转录和翻译水平同时增强。(4)在手术创伤中,随着HSP70的高表达,GR表达下降,两者具有一定的负相关性；诱导HSP70高表达后,GR仍有所下降,肝功能及稳态指标趋于正常或好转；阻断GR后,HSP70更为升高,但肝功能及稳态指标趋于恶化,在手术创伤中HSP70可能参与并启动了抗损伤,在一定程度上反映了肝脏损伤的程度。(5)HSP70与GC、GR均参与手术应激,HSP70影响GR的释放与代谢,GC与GR亦有负相关性；在手术创伤中HSP70与GR之间如何调控有待进一步研究。第三章临床肝癌病人手术后HSP70的变化及意义目的：探讨肝脏切除患者血清HSP70在评价手术创伤程度中的意义。方法：用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝癌患者肝脏切除术前、术后2、12、24、48、72h血清HSP70表达并同时检测血清皮质醇的浓度及检测2、24、48、72、120h肝功能的变化,并进行比较。肝脏切除患者分为开腹左外叶切除、开腹左半肝切除组、开腹左三叶切除组、腹腔镜左外叶切除组。结果：肝脏切除术后2h血清HSP70明显升高,12h维持在高水平,24h达到高峰,48h仍高于正常水平,72h略高于正常；在术后2、12、24、48h随着切除肝量的增加HSP70的表达增加(p＜0.05)；开腹肝脏左外叶切除、左半肝切除组、左三叶切除组三组之间比较在术后2、12、24、48h时相点HSP70的表达有显著性差异(p＜0.05)。血清皮质醇于术后2h迅速增加,12h达到高峰,24小时仍有较高浓度,48h高于正常,72小时恢复正常；在术后12h、24h随着切除肝量的增加皮质醇的浓度明显增加；开腹肝脏左外叶切除组、左半肝切除组、左三叶切除组三组之间在术后12、24h时相点皮质醇浓度有显著性差异(p＜0.05)。腹腔镜左外叶切除组HSP70表达在术后12、24h低于开腹左外叶切除组(P＜0.05),腹腔镜左外叶切除组在术后12h皮质醇浓度低于开腹左外叶切除组(P＜0.05)。术后2hALT、TB开始升高,24h达到峰值,72h明显高于正常,120h接近正常；术后2、24、48、72h ALT、TB均明显高于术前(P＜0.05)。开腹左外叶切除组、开腹左半肝切除组、开腹左三叶切除组三组之间比较在术后24、48、72h ALT、TB浓度有显著性差异(P＜0.05)。腹腔镜左外叶切除组与开腹左半肝切除组、开腹左三叶切除组之间比较在术后24、48、72hALT、TB浓度有显著性差异(P＜0.05)。总蛋白、白蛋白术后2h开始下降,分别于术后24h、72h降至最低,术后120h未恢复到术前水平,术后与术前比较有显著性差异(P＜0.05)；总蛋白在术后24、48、72h开腹左外叶切除组、腹腔镜左外叶切除组分别与开腹左半肝切除组、开腹左三叶切除组之间比较有显著性差异(P＜0.05)。白蛋白在术后72h开腹左三叶切除组与开腹左外叶切除组、开腹左半肝切除组、腹腔镜左外叶切除组之间比较有显著性差异(P＜0.05)。结论：1.手术创伤可以引起血清HSP70和皮质醇浓度的明显升高,两者具有一定的正相关性,且随着手术创伤程度的增加而显著升高；HSP70的表达与肝功能的变化在手术创伤程度及时程上有一致性。2.血清中检测HSP70的表达可以作为判断手术创伤程度的指标。3.腔镜左外叶肝切组较相应开腹组血清HSP70表达及皮质醇浓度降低,提示：腔镜左外叶肝切术较相应开腹术创伤小。