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研究背景及目的脑疟疾(cerebral malaria,CM)是由恶性疟原虫感染所引起的最致命的神经并发症。CM多发生于非洲5岁以下儿童中,占脑型疟死亡总数的90%,即使通过抗疟药治疗得以幸存,10%至20%的儿童仍有神经系统后遗症,造成严重的神经缺损,包括学习和记忆障碍、语言障碍以及行为障碍等。目前,静脉注射抗疟药青蒿琥酯(artesunate,Art)仍然是治疗CM的主要药物,但单独使用Art治疗无法改善神经后遗症,并且非洲落后的医疗条件限制了Art的及时有效应用。本研究采用活血化瘀药中药川芎的有效成分川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)与Art作为一种新的复方组合,探讨Art与TMP联合使用对CM的治疗效果和对神经的改善作用。研究方法C57BL/6小鼠感染伯氏疟原虫Pb ANKA(Plasmodium berghei ANKA)建立实验性脑型疟(experimental cerebral malaria,ECM)模型,将实验小鼠分为模型对照组、Art单药组、TMP单药组和Art+TMP联合给药组。接种第2至4天通过鼻腔给药,统计各组小鼠的生存率、体重和体温,通过吉姆萨染色统计各组小鼠的原虫血症;使用小鼠昏迷及行为量表(Rapid Murine Coma and Behavior Scale,RMCBS)评估ECM小鼠的疾病进程,并通过经典的小鼠行为学实验——空场和Y迷宫实验进一步评价ECM小鼠的行为学表现。HE染色法观察脑血管阻塞情况,MRI观察各组小鼠脑血管血流变化与血管完整性。免疫组化方法评估粘附分子ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表达水平以及星形胶质细胞骨架蛋白GFAP(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经元特异性核蛋白NeuN(neuron-specific nuclear protein,NeuN)的表达水平。应用小鼠细胞因子芯片及ELISA法检测神经营养因子BDNF(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、NT-3(neurotrophic factor-3,NT-3)和生长因子b-NGF(b-nerve growth factor,b-NGF)和VEGF-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A),炎症因子TNF-α、IL-10的表达水平。HE染色进行滴鼻给药的毒理研究。通过iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)蛋白组学进一步分析Art+TMP联合给药对ECM小鼠的保护机制,通过基因功能富集分析和蛋白互作分析挖掘Art+TMP联合给药对ECM小鼠神经保护作用的潜在作用机制,并通过免疫印迹进一步验证蛋白组学数据的可靠性。研究结果Art和TMP联合治疗与Art或TMP单药组相比能提高小鼠的生存率,预防神经症状的发生,显著改善CM导致的体重、体温下降,共济失调、偏瘫、昏迷等临床症状,空场和Y迷宫实验显示Art和TMP联合治疗与Art或TMP单药组相比能显著改善ECM小鼠的运动能力和探索能力。这些作用与减轻ECM小鼠大脑中炎性细胞的浸润和pRBC(parasitized red blood cells,pRBC)的阻塞、降低大脑中粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达,增加脑血流灌注量、维持血管完整性、GFAP表达水平降低和神经元核蛋白NeuN表达增加、神经营养因子表达水平增加以及促炎细胞因子表达水平降低等有关。同时,滴鼻给药的毒理结果发现鼻腔给药安全可行。这些结果表明,Art和TMP联合给药可能是对ECM的神经保护和免疫调节的来源,可以作为改善CM的治疗的抗疟药物。为了阐明Art和TMP联合治疗ECM的可能靶点,根据iTRAQ蛋白组学按照表达差异倍数1.2倍变化以上,p值<0.05,确定了217个下调蛋白和177个上调蛋白,与Art或TMP单独治疗组相比,Art和TMP联合组的蛋白质组特征发生了显著改变。通过功能富集分析和蛋白互作分析Art和TMP联合用药的神经保护效果可能与轴突发育或血脑转运过程有关。结论Art与TMP联合治疗可有效治疗ECM的临床症状,发挥神经保护作用,有望作为临床CM的辅助疗法。iTRAQ蛋白质组学为进一步研究Art和TMP的协同作用提供了资源,并为这种治疗干预提供了潜在的预后生物标志物。