背景和目的:随着人口老龄化增加,病态窦房结综合征的发病率逐年上升,植入电子起搏器是临床上SSS的主要治疗手段,但存在诸多局限性。本实验应用hiPSC作为新的种子细胞,通过添加外源性小分子物质调控窦房结发育生物学信号通路的阶段性级联反应,促进hiPSC向窦房结样起搏细胞诱导分化,为构建心脏生物起搏器提供新的借鉴和新思路,也为将来采用患者自体体细胞构建的hiPSC诱导分化为SANLPCs奠定理论基础和实验准备,以期实现临床上SSS的个体化治疗。方法:（1）采用mTeSRTM1干细胞培养体系扩增培养hiPSC,应用光学显微镜观察hiPSC的细胞形态学特征、绘制hiPSC的生长曲线和倍增曲线。（2）应用细胞免疫荧光染色法检测干细胞特征性蛋白标志物中转录因子（Oct4、Sox2）和核蛋白（Nanog）的表达来鉴定hiPSC的多能性。（3）特殊条件下,通过添加外源性小分子物质调控窦房结发育生物学信号通路的阶段性级联反应,促进hiPSC向窦房结样起搏细胞诱导分化。（4）应用光学显微镜观察hiPSC诱导窦房结样起搏细胞不同分化阶段的的细胞形态学特征、自发性搏动特征及hiPSC衍生的SANLPCs的细胞形态学特征。（5）运用细胞免疫荧光染色和Western blot检测hiPSC的干细胞特征性标志蛋白中的转录因子（Oct4、Sox2）和核蛋白（Nanog）和hiPSC-SANLPCs的特征性标志蛋白（Nkx2.5、TBX3、TBX18、c TNT）、起搏离子通道（HCN4）及其他相关离子通道（Cav1.2、Cav3.1、RYR2及NCX 1.1）的蛋白分布和表达。（6）利用膜片钳技术,在电流钳模式下检测hiPSC衍生的窦房结样起搏细胞的动作电位（AP）,观察自发性动作电位的最大舒张电位（MDP）、动作电位上升相幅值（APA）、四相自动去极化斜率（DDR）及动作电位时程（APD20、APD50、APD90）;在电压钳模式下检测hiPSC衍生的窦房结样起搏细胞的起搏电流（If）和L型钙电流(ICa,L)及相关离子通道门控机制并绘制电流-电压（I-V）曲线、稳态激活（SSA）曲线、稳态失活（SSI）曲线和失活后恢复（RAI）曲线。运用Ca2+免疫荧光技术检测hiPSC衍生的窦房结样起搏细胞的自发性钙波。结果:（1）在mTeSRTM1干细胞培养体系扩增培养hiPSC,呈圆形或类圆形,具有高的核质比,且核仁显著。细胞增殖良好,倍增时间为24小时,属于快速增长型细胞。hiPSC高表达干细胞特异性蛋白标志物Oct4、Sox和Nanog,具有多向分化的潜能。（2）在特殊条件下hiPSC诱导窦房结样起搏细胞分化的细胞形态学特征表现为细胞由圆形或类圆形向长梭形、三角形及不规则的细胞形态转变;至分化第11天左右出现频率为47.2±3.92次/min的局部自发性搏动。随着诱导分化天数的增加,细胞的搏动频率也随之增加,且分化至第30-60天搏动频率趋于稳定。（3）hiPSC-SANLPCs单细胞形态主要表现为长梭形或三角形,具有自发搏动特性。且不表达Nkx2.5,高表达窦房结细胞特异性标志物TBX3、TBX18、c TNT。（4）hiPSC-SANLPCs可产生类似于窦房结细胞样的自发性动作电位,其中有57.1%（20/35）细胞无任何程序性电流刺激下可产生自发性动作电位,且具有较为典型的窦房结细胞特征。（5）hiPSC-SANLPCs具有起搏电流特征。If呈现内向性,具有电压依赖性,电流幅值或密度随着超极化刺激电位向负移动而增大;同时hiPSC-SANLPCs高表达窦房结细胞特征性通道蛋白HCN4,且主要分布于细胞膜上。（6）hiPSC-SANLPCs在去极化刺激下诱发出ICa,L电流,呈内向性,缓慢激活,缓慢失活,其I-V曲线显示ICa,L呈典型的“倒钟形状”。（7）1Hz起搏刺激时,hiPSC-SANLPCs可产生钙波,且hiPSC-SANLPCs高表达Cav1.2、Cav3.1、RYR2及NCX 1.1离子通道蛋白。结论:（1）在mTeSRTM1干细胞培养体系中扩增培养的hiPSC,细胞增殖良好,属于快速增长型细胞,维持干细胞特有的形态学特征,具有自我更新和多向分化的潜能。（2）hiPSC-SANLPCs呈长梭形或三角形的细胞形态,类似于窦房结细胞;搏动频率随培养时间的增加而增加,分化至30-60天细胞搏动频率趋于稳定。（3）hiPSC-SANLPCs表达高水平的窦房结细胞特异性标志物,表明hiPSC-SANLPCs类似于窦房结细胞。（4）hiPSC-SANLPCs会自发收缩,表现出与体内窦房结细胞相似的动作电位。hiPSC-SANLPCs具有代表膜钟的起搏电流,发现起搏电流及其分子基础;并具有代表钙钟的L型钙电流和胞内钙改变,与正常窦房结细胞相似。