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目的:通过构建敲减、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3和Hela细胞系,研究OPTN基因表达影响SKOV3和Hela细胞对抗癌药物DDP的敏感性。方法:针对人OPTN基因序列设计sh RNA(敲减)、sg RNA(敲除)、LV-OPTN(过表达)的序列,构建慢病毒表达载体,转染293T细胞获得慢病毒上清,并感染SKOV3、Hela细胞,经过筛选获得稳定的敲低、敲除、过表达的SKOV3、Hela细胞系。PCR检测敲除OPTN基因,RT-PCR检测敲减、过表达前后OPTN基因表达量的变化;Western blot检测敲低、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3和Hela细胞OPTN蛋白表达的变化;MTT法检测DDP对敲低、敲除、过表达OPTN的SKOV3、Hela细胞增殖的影响;流式细胞仪检测OPTN的表达对SKOV3、Hela细胞凋亡的影响;q RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、m TOR、MDR1、ERCC1、BRCA1的基因表达量(m RNA和蛋白质)的变化,探讨其对PI3K-AKT-m TOR信号通路、凋亡和耐药相关基因表达的影响。结果:1、成功构建敲减、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3、Hela细胞系。2、MTT结果显示,在DDP作用下,敲减和敲除组两种癌细胞的增殖抑制率与对照组相比下降,而过表达组的细胞增殖抑制率与对照组相比上升。3、流式结果显示,在DDP作用下,敲减和敲除组两种癌细胞的凋亡率与对照组相比下降,过表达组的细胞凋亡率与对照组细胞相比上升。4、q RT-PCR结果显示敲减和敲除组细胞caspase3、Bax的基因表达量相比于对照组下降,Bcl-2、PI3K、AKT、m TOR、MDR1、ERCC1、BRCA1基因的表达量相比于对照组上升,而过表达组细胞的上述基因表达的m RNA变化相反。5、Western blot结果显示敲减和敲除组细胞Cleavedcaspase3、Procaspase3、Bax的蛋白表达量相比于对照组下降,Bcl-2、PI3K-AKT-m TOR信号通路相关蛋白、MDR1、ERCC1、BRCA1的蛋白表达量相比于对照组上升,过表达组细胞的蛋白表达量变化相反。结论:OPTN基因的表达促进了SKOV3、Hela细胞的凋亡和对抗癌药物DDP的敏感性,可能的机制是通过调节PI3K-AKT-m TOR信号通路,进而调节了Bax/Bcl-2凋亡基因的表达,同时OPTN的表达下调了MDR1、ERCC1、BRCA1等耐药相关基因的表达而促使细胞耐药性的下降,可能的机制也是通过调节PI3K-AKT-m TOR信号通路来实现的。