胰岛素样生长因子(IGF-1)是一种通过循环系统发挥功能的内分泌型生理调控因子，在发育过程中通过调节细胞的增殖、分化、凋亡来发挥其作用。成熟的IGF-1是一个由70个氨基酸组成的单链碱性蛋白，在所有变异体中结构相同。IGF-1基因包含6个外显子，可通过选择性剪接产生不同mRNA，从而形成不同的变异体，每种变异体都由信号肽、IGF-1多肽和E肽三部分组成。　　 力生长因子（mechano-growthfactor，MGF）是IGF-1选择性剪接变异体的一种，其特点是比IGF-I的羧基端多出个延伸肽(extentionpeptide，E肽)，并且由于来自外显子5的49bp(啮齿类动物是52bp)序列的插入，导致外显子6的阅读框发生移码突变，从而产生了特异性的C端24个氨基酸残基的E肽序列(MGF-24E)。研究发现，MGF能够激活肌肉卫星细胞，促进组织再生，在受应力刺激的肌肉、骨骼，以及损伤的神经、肌肉组织中均有发现MGF在局部组织中高表达;而人工合成的MGF-24E多肽同样具有促进多种细胞增殖和存活的作用。MGF-24E又是MGF区别于其它IGF-1剪接异构体的特异性末端延伸肽，由此，研究者推测MGF-24E可能是MGF的作用中心，但目前尚无有力论据，这个问题也成为大家关注的热点。　　 IGF-1基因选择性剪接产生的多种变异体都具有神经保护作用，其中MGF的作用更为显著。2004年，AperghisM等首次发现MGF对神经元撕裂造成的神经元损失起到有效保护作用，拉开了MGF神经修复作用研究的序幕;此外，质粒注射MGF至患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症的小鼠肌肉细胞，能够促进脊髓运动神经元存活;近期研究表明，MGF能诱导血红素加氧酶表达增加，从而保护SH-SY5Y细胞抵抗由于6-羟多巴胺诱导的细胞调亡。所有的这些研究结果为一些神经损伤疾病，譬如帕金森病的治疗提供了新的思路。MGF作为一个局部作用因子，其作用模式独立于其他变异体。合成的MGF能激活ERK1/2，而不影响Akt的磷酸化，而IGF-1是通过Akt起作用的，由此可推测，MGF可能是独立于IGF-1，通过ERK信号通路发挥增殖作用。MGF作为一种力响应因子，目前其膜上受体仍不明确，其分子机制有待进一步探索。　　 力生长因子在神经损伤修复方面的研究已经取得较大进展，但鉴于以往对其研究多采用MGF重组质粒直接注射受损组织或通过传统原核表达以及化学合成的方法得到目的蛋白，虽操作简便，同时也存在蛋白表达量低、效力不明显、作用周期短、蛋白功能不够完善等问题，从而局限了MGF在临床上的应用。近年来，随着基因治疗和重组疫苗研究的深入，作为其基础的载体的研究有了突飞猛进的发展，腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体。本研究采用Ad-Easy重组腺病毒包装系统，首次成功构建人的MGF及其末端E肽重组腺病毒，并以神经元细胞和神经胶质细胞的典型代表SH-SY5Y和N9细胞为作用对象，在两种细胞中实现过表达，解决了传统方法的局限性。进而比较MGF和MGF-24E对神经细胞增殖作用的差异，全面科学地阐述了力生长因子的神经保护作用，同时为确定MGF的作用位点奠定理论基础。研究主要包括以下内容:　　 1.分别构建MGF及其E肽重组腺病毒。采用Ad-Easy法进行MGF和MGF-24E重组腺病毒的包装。首先通过序列的比对，采用人工合成的方法，获得人类MGF及其末端24肽基因序列，连接穿梭质粒pAdTrack-cmv，得到pAdTrack-MGF和pAdTrack-24E重组穿梭质粒;重组穿梭质粒电转化含骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌，在胞内完成质粒间的同源重组;重组腺病毒质粒线性化后，经脂质体介导，转染HEK293A细胞，完成目的基因腺病毒的包装和增殖，经PCR鉴定，重组腺病毒含有所需目的片段，成功构建了MGF和MGF-24E重组腺病毒。　　 2.重组腺病毒在神经细胞中的表达鉴定。经包装构建的重组腺病毒，经反复感染增殖，使其效价不断提高，TCID50（50％组织培养感染剂量法）检测病毒滴度，Karber法计算TCID50。结果显示TCID50(MGF)=10-6.2/100μL;TCID50(MGF-24E)=1053/100μL，达到感染所需效价。分别用MGF和MGF-24E重组腺病毒感染N9、SH-SY5Y细胞，24h后在荧光显微镜下观察。结果显示:两种细胞均能被包装得到的腺病毒高效率感染，胞浆和胞核都有GFP的表达。收集感染细胞，采用超声破碎的方法提取细胞裂解液，SDS-PAGE分析，Anti-6*His-Tag特异性抗体作Western-blot检测，在MGF和MGF-24E重组腺病毒感染的N9、SH-SY5Y细胞中，分别有分子量约为20kD和2.94kD的蛋白条带，与预期值大小相符。表明经腺病毒介导，MGF和MGF-24E均能够在作用细胞N9、SH-SY5Y中高效表达。　　 3.MGF及其E肽对神经细胞增殖的影响。将处于对数生长期的N9和SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，待细胞融合度达到约30％，分别加入用无血清培养基稀释的重组腺病毒MGF和MGF-24E，每个操作设置3个重复，同时设置空白对照组，MTT法检测MGF和MGF-24E对N9、SH-SY5Y细胞增殖的时间效应和浓度效应。结果显示，不同浓度的MGF和MGF-24对N9、SH-SY5Y的增殖均有明显促进作用，且随着滴度的增加，促进作用越强;同一浓度的MGF和MGF-24重组腺病毒在不同时间段对N9、SH-SY5Y的增殖均有促进作用，且与对照组比较在36h、48h的增殖差异具有极显著性(P＜0.01)。MGF处理组与MGF-24E处理组基本无差异(P＞0.05)。由此可见，MGF具有促进神经细胞增殖的功能，其在神经损伤修复方面有着不可小觑的作用，而MGF-24E表现出与MGF同样的生物活性，这就初步证实MGF-24E可能是MGF的活性位点，即MGF是通过其末端短肽发生作用的。