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研究背景与目的肺癌是当今世界上发病率最高的恶性肿瘤，其最主要的致死原因是肿瘤的远处转移。DAL-1是一个抑癌基因，我们在前期试验中证明了DAL-1基因参与肺癌的增殖和转移过程的调控，由此提示DAL-1可作为肺癌的治疗靶点。腺病毒载体是最常用的基因治疗载体，在临床应用中其面临两大瓶颈：免疫原性强和缺乏靶向性。鉴于其靶向性差，学者提出条件复制性腺病毒的概念。条件复制性腺病毒能够选择性地在肿瘤细胞中完成感染和复制周期，从而特异性溶解肿瘤细胞，却不伤及正常组织。条件复制性腺病毒目前最需解决的问题是，如何提高驱动腺病毒复制的启动子的肿瘤靶向性。CXCR4是趋化因子SDF-1的特异性受体，研究指出CXCR4在超过20种不同类型肿瘤中有表达，而在非肿瘤组织中几乎不表达，另外CXCR4启动子也被证实了在肝脏中的低毒性，因此CXCR4启动子是较理想的肿瘤特异性启动子。间充质来源干细胞已被证实具有免疫原性低的特性和肿瘤归巢能力。人羊水干细胞属于间充质来源干细胞的一种，其取材安全、不涉及伦理道德问题和无成瘤性，有望成为理想的干细胞种子来源，人羊水干细胞现主要应用与再生领域，然而关于利用人羊水干细胞治疗恶性肿瘤的研究却鲜有报道。综上所述，为增强条件复制性腺病毒的靶向性和杀伤力，本研究拟构建一个新的载体Ad-CXCR4-DAL-1并转染人羊水干细胞。利用CXCR4启动子能特异性使腺病毒在靶细胞内复制并溶解靶细胞，DAL-1能特异性抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡，人羊水干细胞具有免疫原性低和肿瘤归巢的特性，旨在通过构建的特异性双靶向溶瘤病毒载体，降低腺病毒对非靶器官的毒副作用，联合抑癌基因以提高对肿瘤细胞的杀伤效应，利用人羊水干细胞携带Ad-CXCR4-DAL-1以降低腺病毒免疫原性，定点归巢于肿瘤局部，从而提高对肿瘤的靶向杀伤效应，为基因治疗提供一种新的策略。方法一、条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP的构建：构建重组质粒pAdxsi-CXCR4-DAL-1和pAdxsi-CXCR4-GFP，利用293细胞包装成条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP；TCID50法测定Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP滴度。二、CXCR4在A549细胞内启动活性的检测、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1转染A549细胞后复制数和DAL-1表达的检测：荧光定量PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4mRNA表达，筛选出表达最高的A549细胞；将构建的Ad-CXCR4-DAL-1（实验组）、Ad-CXCR4-GFP（对照组）和Ad-NULL（空载体组）分别转染至A549细胞中，荧光定量PCR检测各组E1AmRNA、E4DNA和DAL-1mRNA表达；Western Blot检测各组DAL-1蛋白的表达。三、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1功能的检测：实验分四组：实验组、对照组、空载体组和空白对照组。流式细胞仪检测各组分别转染A549细胞和16HBE细胞后的凋亡率；CCK-8实验检测各组分别转染A549细胞和16HBE细胞后的细胞毒性，计算各组细胞活性率。四、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1体内抑瘤作用的检测：实验分三组：实验组、空载体组和PBS组。2*106个A549细胞重悬于200μLPBS，注射至裸鼠皮下，建立裸鼠A549细胞移植瘤模型。瘤内注射各组病毒，每隔1天注射1次，每次每只1*109PFU，共4次。观察各组肿瘤生长速度和肿瘤体积；末次注射后的第21天处死全部裸鼠，分别称取各组裸鼠肿瘤重量，各组均取出肿瘤、肝脏和肺脏，荧光定量PCR检测各组肿瘤、肝脏和肺脏中E4DNA和DAL-1mRNA表达。五、人羊水干细胞的分离与鉴定：采用贴壁法分离培养人羊水干细胞；对第2代人羊水干细胞进行核型分析；流式细胞仪检测第2代人羊水干细胞表面抗原分子的表达；CCK-8实验检测第2代人羊水干细胞的增殖情况，连续检测5天，根据吸光度（OD）值描绘生长曲线。六、携带条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1的人羊水干细胞对肺癌作用的检测：将人羊水干细胞转染Ad-CXCR4-DAL-1（实验组）和Ad-NULL（空载体组），并设单纯人羊水干细胞组（hAFS组）和PBS组为对照。2*106个A549细胞重悬于200μLPBS，注射至裸鼠皮下，建立裸鼠A549细胞移植瘤模型。分别将各组进行瘤内和尾静脉注射至裸鼠A549细胞移植瘤模型中，观察每组肿瘤生长速度和肿瘤体积；经尾静脉注射后第7天每组取出1只裸鼠，利用活体成像系统观察人羊水干细胞肿瘤归巢能力；末次注射后的第21天处死全部裸鼠，分别称取各组裸鼠肿瘤重量，经瘤内注射的裸鼠处死后取出肿瘤、肝脏和肺脏，荧光定量PCR检测各组所取器官E4DNA和DAL-1mRNA表达。经尾静脉注射的裸鼠处死后取出肿瘤、肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、睾丸、小肠，荧光定量PCR检测各组所取器官E4DNA和DAL-1mRNA表达。结果一、重组质粒pAdxsi-CXCR4-DAL-1和pAdxsi-CXCR4-GFP经PCR鉴定分别显示1301bp、3204bp两条带和1301bp条带，证实插入片段大小与预期一致，测序结果显示扩增的目的片段序列与GenBank提供序列完全匹配，转染293细胞后包装出条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP，滴度测定分别为2*1011PFU/mL和1*1010PFU/mL。条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP成功构建。二、各组转染A549细胞后，荧光定量PCR及Western Blot检测结果显示：实验组和对照组的E1AmRNA和E4DNA表达较空载体组明显上升（P<0.01）；实验组和对照组的E1A mRNA和E4DNA表达比较无明显差异（P>0.05）；实验组DAL-1mRNA表达和DAL-1蛋白表达较对照组和空载体组明显上升（P<0.01）。实验证明CXCR4在A549细胞内有较高的启动活性；条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1转染A549细胞后有较高的复制数和DAL-1表达。三、各组分别转染至A549细胞和16HBE细胞后，流式细胞仪检测显示，与空载体组和空白对照组相比，对照组前4天细胞凋亡率无明显差异（P>0.05），第5天凋亡率明显增加（P<0.01）；CCK-8毒性实验显示，对照组前4天细胞活性率无明显差异（P>0.05），第5天活性率明显降低（P<0.01）；流式细胞仪与CCK-8-检测显示各组间5天内16HBE的凋亡率和细胞活性率均无明显差异（P>0.05）；与对照组相比，实验组前3天细胞凋亡率和细胞活性率无明显差异（P>0.05），第4天凋亡率增加（P<0.01），细胞活性率降低（P<0.01），第5天凋亡率明显增加（P<0.01），细胞活性率明显降低（P<0.01）。体外实验证明CXCR4启动的条件复制型腺病毒对肺癌具有靶向溶瘤作用；DAL-1促进细胞凋亡，增强了Ad-CXCR4-DAL-1对肺癌的杀伤能力。四、裸鼠瘤内注射各组病毒后，实验组与空载体组、PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较差异明显（P<0.01）；空载体组与PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异（P>0.05）；荧光定量PCR显示，实验组E4DNA和DAL-1mRNA表达较空载体组与PBS组明显增加（P<0.01）；各组肝脏和肺脏均无E4DNA和DAL-1mRNA表达。体内实验证明条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1能够抑制肺癌的生长，且对机体无产生毒性。五、人羊水干细胞原代培养贴壁后，呈集落式生长，可见上皮样及成纤维样两种集落，细胞传代后生长迅速，传至第2代后生长速度及形态均无明显改变；第2代人羊水干细胞核型分析是46（X，Y），为人正常二倍体核型；第2代人羊水干细胞表达间充质来源干细胞的标志CD29、CD44、CD90和CD105，而造血干细胞表面标志CD45、CD34则呈阴性表达；第2代人羊水干细胞增长迅速，细胞倍增时间约为24h。实验证明人羊水干细胞分离与鉴定成功。六、裸鼠注射各组病毒后，经瘤内注射的裸鼠，实验组与空载体组、hAFS组、PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较差异明显(P<0.05)；空载体组、hAFS组和PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异（P>0.05）；荧光定量PCR显示，实验组E4DNA和DAL-1mRNA表达较空载体组、hAFS组和PBS组明显上升（P<0.01）。各组肝脏和肺脏均无E4DNA和DAL-1mRNA表达。实验证明条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1能在人羊水干细胞内高效复制和释放，并能发挥抑瘤作用。七、经尾静脉注射的裸鼠，活体成像系统检测显示，实验组、空载体组和hAFS组裸鼠经尾静脉注射7d后，在肿瘤周边出现荧光信号， PBS组肿瘤无荧光信号；实验组、空载体组和hAFS组总光子数较PBS组有明显差异（P<0.01），实验组、空载体组和hAFS组总光子数比较无明显差异（P>0.05），证明人羊水干细胞具有肺癌归巢能力。实验组、空载体组、hAFS组和PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异(P>0.05)，但有减少趋势；空载体组、hAFS组和PBS组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量比较无明显差异（P>0.05）；荧光定量PCR显示，实验组E4DNA和DAL-1mRNA表达较空载体组、hAFS组和PBS组上升（P<0.05）。各组所取器官均无E4DNA和DAL-1mRNA表达。实验证明携带条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1的人羊水干细胞能够提高肺癌靶向性，降低腺病毒免疫原性，对肺癌具有杀伤作用。结论一、成功构建条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-DAL-1和Ad-CXCR4-GFP。二、CXCR4启动的条件复制型腺病毒对肺癌具有靶向溶瘤作用；DAL-1促进细胞凋亡，增强了条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1对肺癌的杀伤能力。三、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1在体内能够抑制肺癌的生长。四、人羊水干细胞具有肺癌归巢能力，携带条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1的人羊水干细胞能够提高肺癌靶向性，降低腺病毒免疫原性，对肺癌具有杀伤作用。